Gràcies per visitar Nature.com.La versió del navegador que utilitzeu té un suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).Mentrestant, per garantir un suport continuat, renderitzarem el lloc sense estils ni JavaScript.
Les cèl·lules canceroses han desenvolupat diversos mecanismes per superar l'estrès cel·lular i continuar progressant.La proteïna cinasa R (PKR) i el seu activador de proteïnes (PACT) són els primers responsables que controlen diversos senyals d'estrès que condueixen a la inhibició de la proliferació cel·lular i l'apoptosi.No obstant això, la regulació de la via PACT-PKR a les cèl·lules canceroses segueix sent molt desconeguda.Aquí, vam trobar que l'ARN antisentit aspartil tRNA sintetasa ARN 1 (DARS-AS1) llarg no codificant (lncRNA) està directament implicat en la inhibició de la via PACT-PKR i promou la proliferació de cèl·lules canceroses.Utilitzant el cribratge funcional a gran escala de lncRNA associat al càncer CRISPRi 971, vam trobar que DARS-AS1 estava associat amb una proliferació de cèl·lules canceroses significativament millorada.Per tant, l'eliminació de DARS-AS1 inhibeix la proliferació cel·lular i promou l'apoptosi de cèl·lules canceroses en diverses línies de cèl·lules canceroses in vitro i redueix significativament el creixement del tumor in vivo.Mecànicament, DARS-AS1 s'uneix directament al domini d'activació PACT i impedeix la interacció PACT-PKR, reduint així l'activació de PKR, la fosforilació eIF2α i inhibint la mort cel·lular apoptòtica.Clínicament, DARS-AS1 s'expressa àmpliament en múltiples càncers, i la sobreexpressió d'aquest lncRNA és indicativa d'un mal pronòstic.Aquest estudi dilucida la regulació específica del càncer de la via PACT-PKR per DARS-AS1 lncRNA i proporciona un altre objectiu per al pronòstic i el tractament del càncer.
La capacitat d'adaptar-se a l'estrès és una característica important de la supervivència i la proliferació de cèl·lules canceroses.La ràpida proliferació i les característiques metabòliques del càncer assoleixen el pic en microambients durs (privació de nutrients, hipòxia i pH baix) que poden desencadenar vies de senyalització de la mort cel·lular.La desregulació de gens sensibles a l'estrès com p535, proteïnes de xoc tèrmic 6, 7, KRAS8, 9 i HIF-110, 11, 12, 13 s'observa amb freqüència en el càncer, bloquejant així l'apoptosi i afavorint la supervivència.
La proteïna quinasa R (PKR) és un important sensor d'estrès i subunitat quinasa del factor d'iniciació eucariota 2α (eIF2α), un regulador de translació que vincula l'estrès cel·lular amb la mort cel·lular.La PKR es va identificar originalment com una proteïna antiviral mitjançant la detecció d'un ARN de doble cadena estrany (ARNds).Després de l'activació, PKR fosforila eIF2α per inhibir la síntesi de proteïnes virals i cel·lulars14,15,16.PACT (proteïna activadora PKR) s'ha identificat com la primera proteïna activadora PKR en absència de dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Mitjançant la interacció directa amb PKR, PACT transdueix diverses tensions (inani de sèrum, tractament amb peròxid o arsenit) a PKR i vies de senyalització aigües avall.A més de la fosforilació eIF2α, l'activació de PKR mediada per PACT desencadena diversos esdeveniments associats a la resposta a l'estrès, inclòs l'estat redox alterat a través de la via PI3K/Akt24, la comprovació millorada de danys a l'ADN mitjançant p5325,26 i NF-κB27,28 Regula la transcripció, 29. Donat el seu paper crític en la resposta a l'estrès, la proliferació, l'apoptosi i altres processos cel·lulars clau, PKR i PACT són objectius terapèutics prometedors per a moltes malalties, especialment el càncer30,31,32,33.No obstant això, malgrat aquesta importància funcional i biològica pleiotròpica, la regulació de l'activitat PACT/PKR a les cèl·lules canceroses continua essent difícil.
Els lncRNA són transcripcions de més de 200 nucleòtids sense potencial de codificació de proteïnes.Atès que els projectes d'avantguarda de seqüenciació del genoma sencer han identificat milers de lncRNAs,35,36 s'han fet molts esforços per dilucidar les seves funcions biològiques.Un nombre creixent d'investigacions ha demostrat que els lncRNA estan implicats en molts processos biològics37 incloent la regulació de la inactivació del cromosoma X38,39, la impressió40, la transcripció41,42, la traducció43 i fins i tot el creixement del càncer44,45,46,47.Aquests estudis van informar que molts lncRNA estan implicats en la via PACT/PKR.Un d'aquests estudis va demostrar que lncRNA ASPACT va inhibir la transcripció de PACT i va augmentar la retenció nuclear de l'ARNm de PACT.Altres estudis han demostrat que lncRNA nc886 s'uneix a PKR i inhibeix la seva fosforilació49,50.Fins ara, no s'ha informat de l'activació de PKR mediada per PACT que regula l'ARNnc.
L'ARN 1 antisentit de l'aspartil-tRNA sintetasa (DARS-AS1) s'ha identificat com un lncRNA oncogènic51,52,53,54.Mitjançant la regulació de miP-194-5p53, miP-12952 i miP-532-3p51, s'ha demostrat que DARS-AS1 promou el creixement del carcinoma renal de cèl·lules clares, el carcinoma de tiroides i el carcinoma de pulmó de cèl·lules no petites, respectivament.Tong i els seus col·legues també van trobar que DARS-AS1 promou la progressió del mieloma mantenint l'estabilitat del motiu d'unió a l'ARN de la proteïna 39 (RBM39).Tanmateix, no s'han realitzat estudis sobre si aquest lncRNA està implicat en la regulació de l'activació de PACT-PKR i la resposta a l'estrès de les cèl·lules canceroses.
Aquí, vam realitzar una pantalla de pèrdua de funció a gran escala mitjançant el sistema CRISPRi i vam determinar que el lncRNA DARS-AS1 promou la proliferació de diversos tipus de cèl·lules canceroses.A més, hem identificat un mecanisme important: DARS-AS1 s'uneix directament a PACT, inhibeix la unió de PACT i PKR, prevé la fosforilació d'eIF2α, un substrat de PKR inferior i, finalment, inhibeix la mort cel·lular apoptòtica.En conclusió, el nostre treball revela el lncRNA DARS-AS1 com a regulador de la via PACT-PKR i un objectiu potencial per al tractament i el pronòstic del càncer.
Estudis amplis de perfils genòmics han identificat centenars de lncRNAs associats al càncer.No obstant això, la seva funció segueix sent molt desconeguda56.Per identificar candidats prometedors de lncRNA implicats en la progressió del càncer, vam realitzar una pantalla de pèrdua de funció per a una proliferació reduïda a la línia cel·lular de càncer colorectal SW620 mitjançant el sistema CRISPRi (Fig. 1a).La característica única de les línies cel·lulars de càncer de còlon SW480 i SW620 és que es deriven de tumors primaris i secundaris en un sol pacient.Això proporciona una comparació valuosa per estudiar els canvis genètics en la progressió del càncer de còlon avançat.Per tant, vam analitzar els transcriptomes de línies cel·lulars de càncer colorectal (SW480 i SW620) mitjançant la seqüenciació d'ARN i vam recollir alguns lncRNAs funcionals potencials de la literatura publicada.A partir d'aquests resultats, vam dissenyar una biblioteca de sgRNA agrupada que conté 7355 oligos sgRNA dirigits a 971 lncRNA associats al càncer i 500 oligos sgRNA no orientats per a un control negatiu (dades suplementàries 1).
Representació esquemàtica del cribratge mitjançant el sistema CRISPRi.b enriquiment de sgRNA després del cribratge.La línia de punts horitzontal representa log2 (canvi de plec) = ±0,58.La línia de punts vertical indica el valor p = 0,05.Els punts negres representen sgRNA no objectiu (designat com NC).Els punts vermells són ARNsg dirigits a DARS-AS1.Els punts blaus són ARNsg dirigits a LINC00205, un lncRNA oncogènic descrit anteriorment.canvi de plec = (lectura normalitzada, dia 17)/(lectura normalitzada, dia 0).c La derrota de l'sgRNA de DARS-AS1 va inhibir el creixement cel·lular.Les barres d'error representen ± desviació estàndard dels tres experiments.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 Prova t de Student de dues cues.d Expressió DARS-AS1 en tumors (conjunt de dades TCGA).em Expressió de DARS-AS1 en mostres normals i tumorals aparellades de pacients amb BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP i COAD, respectivament (conjunt de dades TCGA).Els valors p es van obtenir mitjançant la prova t de Student de dues cues aparellades.
Després de construir el plasmidi i empaquetar el lentivirus, vam transduir la línia cel·lular de càncer colorectal dCas9-SW620 amb la biblioteca anterior en quatre experiments d'infecció independents.La multiplicitat d'infeccions (MOI) per a aquestes infeccions va ser de 0,1 a 0,3, cosa que indica que cada cèl·lula només es pot transfectar amb un ARNsg.Després de 18 dies de cultiu in vitro, el perfil d'enriquiment dels ARNsg objectiu va disminuir o augmentar després del cribratge, mentre que el nombre d'oligonucleòtids de control no dirigits es va mantenir relativament sense canvis en comparació amb el perfil de predetecció, cosa que indica que el nostre objectiu té una pantalla molt específica. biblioteca.Arròs.1b i taula complementària 1). LINC00205, que es va informar anteriorment que promou el càncer de pulmó i la progressió del càncer de fetge58,59,60, es va eliminar (log2 (foldchange) <-0,58, valor p <0,05), confirmant la fiabilitat d'aquest cribratge (Fig. 1b). LINC00205, que es va informar anteriorment que promou el càncer de pulmó i la progressió del càncer de fetge58,59,60, es va eliminar (log2 (foldchange) <-0,58, valor p <0,05), confirmant la fiabilitat d'aquest cribratge (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, prèviament informat per promoure la progressió del càncer de pulmó i càncer de fetge58,59,60, es va excloure (log2 (canvi de vegades) <-0,58, valor p <0,05), confirmant la robustesa d'aquest cribratge (Fig. .1b) . LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0,58 ， P 值 <0,05） 证实 证实 了 该 筛选 筛选 的 可靠性 （图 1B）。 LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0,58 ， P 值 <0,05） 证实 证实 了 该 筛选 筛选 的 可靠性 （图 1B）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, prèviament informat que promou la progressió del càncer de pulmó i fetge58,59,60, es va excloure (log2 (canvi de vegades) <-0,58, valor p <0,05), confirmant la robustesa d'aquest cribratge (Fig. .1b).
Entre tots els lncRNAs provats, també es va examinar DARS-AS1, amb els tres oligonucleòtids sgRNA afins reduïts significativament després de 18 dies de cultiu, cosa que suggereix que la derrota d'aquest lncRNA va provocar una reducció de la proliferació del càncer (Fig. 1b).Aquest resultat va ser recolzat encara més per l'anàlisi de MTS en cèl·lules de càncer colorectal que mostrava que la taxa de creixement de les cèl·lules de derrota DARS-AS1 només es va reduir a la meitat en comparació amb les cèl·lules de control (figura 1c) i era coherent amb els informes anteriors de diversos altres tipus de càncer.: càncer de ronyó de cèl·lules clares, càncer de tiroide i càncer de pulmó de cèl·lules no petites51,52,53,55.Tanmateix, la seva funció i mecanismes moleculars en el càncer colorectal segueixen sense explorar.Per tant, vam triar aquest lncRNA per a un estudi posterior.
Per estudiar l'expressió DARS-AS1 en pacients, vam analitzar exhaustivament 10.327 mostres de tumor del projecte Cancer Genome Atlas (TCGA).Els nostres resultats mostren que DARS-AS1 s'expressa àmpliament i es regula significativament en cèl·lules sanes en una varietat de tumors, inclosos l'adenocarcinoma de còlon (COAD), el carcinoma de cèl·lules clares renals (KIRC) i el carcinoma de cèl·lules papil·lars renals (KIRP)..Molt pocs (Fig. 1d i Fig. 1a, b suplementària). L'anàlisi de mostres sanes/tumorals aparellades va confirmar encara més una expressió significativament més alta de DARS-AS1 en els tumors de carcinoma urotelial de bufeta (BLCA), carcinoma de cèl·lules clares renals (KIRC), adenocarcinoma de pròstata (PRAD), carcinoma de cèl·lules escamoses de pulmó (LUSC) , carcinoma d'endometri del cos uterí (UCEC), adenocarcinoma de pulmó (LUAD), carcinoma hepatocel·lular hepàtic (LIHC), carcinoma de cèl·lules papil·lars renals de ronyó (KIRP) i adenocarcinoma de còlon (COAD) (valor de p < 0,05) (Fig. 1e-m) . L'anàlisi de mostres sanes/tumorals aparellades va confirmar encara més una expressió significativament més alta de DARS-AS1 en els tumors de carcinoma urotelial de bufeta (BLCA), carcinoma de cèl·lules clares renals (KIRC), adenocarcinoma de pròstata (PRAD), carcinoma de cèl·lules escamoses de pulmó (LUSC) , carcinoma d'endometri del cos uterí (UCEC), adenocarcinoma de pulmó (LUAD), carcinoma hepatocel·lular hepàtic (LIHC), carcinoma de cèl·lules papil·lars renals de ronyó (KIRP) i adenocarcinoma de còlon (COAD) (valor de p < 0,05) (Fig. 1e-m) .L'anàlisi de mostres sanes/tumorals aparellades també va confirmar una expressió significativament més alta de DARS-AS1 en carcinoma urotelial de bufeta (BLCA), carcinoma renal i renal de cèl·lules clares (KIRC), adenocarcinoma de pròstata (PRAD), carcinoma de cèl·lules escamoses de pulmó (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , carcinoma endometrial del cos úter (UCEC), adenocarcinoma de pulmó (LUAD), carcinoma hepatocel·lular del fetge (LIHC), carcinoma de cèl·lules papil·lars del ronyó (KIRP) i adenocarcinoma de còlon (COAD) (valor p < 0,05) (Fig. 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 Dars-as1 在 膀胱 上 皮癌 皮癌 (blca) 、 肾 肾 透明 细胞癌 (kirc) 、 前列 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌 (lusc) 肿瘤 中 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的显着 更 高 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （UCEC） ， 肺腺癌 （luad） ， 细胞癌 （（lihc） ， 肾 乳头状 细胞癌 （（Kirp） （COAD） （P 值<0,05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 Dars-os1 在 尿路 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(LUSC) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 高 ， 内膜 癌 癌 （（UCEL AT癌 （kirp） （coad） （p 值<0,05）（图1e-m） .L'anàlisi de mostres aparellades sanes/tumorals va donar suport encara més al paper de DARS-AS1 en el carcinoma urotelial de la bufeta (BLCA), el carcinoma de cèl·lules renals de cèl·lules clares (KIRC), l'adenocarcinoma de pròstata (PRAD) i els tumors de carcinoma de cèl·lules escamoses de pulmó (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). expressió en carcinoma de corpus uterí (UCEC), adenocarcinoma pulmonar (LUAD), carcinoma hepatocel·lular (LIHC), carcinoma de cèl·lules papil·lars renals (KIRP) i adenocarcinoma de còlon (COAD) (valor p <0, 05) (Figura 1e -m).En conjunt, aquests resultats indiquen que DARS-AS1 està àmpliament i altament expressat en una varietat de càncers.
Com que DARS-AS1 i DARS (el gen que codifica la cadena antisentit) comparteixen el mateix promotor i es troben l'un al costat de l'altre, hem dissenyat shRNA per derrocar específicament DARS-AS1 però no DARS (figura suplementària 2a, b i taula suplementària 2) .A més de SW620, també vam utilitzar altres tres línies cel·lulars que expressaven altament DARS-AS1 per estudiar l'eficàcia i la funció de la derrota de l'shRNA (taula suplementària 3).Els nostres resultats van indicar que els tres shRNA desenvolupats van aconseguir almenys un 80% d'eficiència de derrocament de DARS-AS1 amb poc efecte sobre la quantitat d'ARNm de DARS (figura suplementària 2c-f).A més, vam trobar que la derrota de DARS-AS1 amb aquests shRNAs va inhibir significativament el creixement cel·lular a les línies cel·lulars de càncer colorectal SW620 (49,7%) i HCT116 (27,7%), línia cel·lular de càncer de mama MBA-MD-231 (53,4%).) i la línia cel·lular d'hepatoma HepG2 (reducció del 92, 7%), així com la seva capacitat per formar esferes no ancorades (reducció mitjana del ~ 50, 8%, 44, 6%, 40, 7% i 75, 7% per línia cel·lular) (Fig. 2a, b).A SW620, els resultats de l'assaig de formació de colònies van confirmar encara més que l'shRNA DARS-AS1 va inhibir significativament la proliferació cel·lular amb una disminució mitjana d'aproximadament un 69, 6% (Fig. 2c).
Efecte del control shRNA i DARS-AS1 shRNA sobre la proliferació cel·lular (a) i la formació d'esferoides (b) a les cèl·lules SW620, HCT116, MBA-MD-231 i HepG2.c Efecte del control shRNA i DARS-AS1 shRNA sobre la formació de colònies a les cèl·lules SW620.Proliferació cel·lular (d), formació d'esferoides (e) i formació de colònies (f) de cèl·lules SW620 que sobreexpressen DARS-AS1.Les dades mostrades són la mitjana ± desviació estàndard de tres experiments.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 i *** p ≤ 0,001 mitjançant la prova t de Student de dues cues.
Per complementar els estudis de pèrdua de funció, a continuació vam crear cèl·lules SW620 que sobreexpressen DARS-AS1 (figura suplementària 2g).La sobreexpressió de DARS-AS1 va augmentar significativament el creixement cel·lular (1, 8 vegades), la formació d'esferoides no ancorats (1, 4 vegades) i la formació de colònies (3, 3 vegades) a les cèl·lules SW620 (Fig. 2d-f).Vam confirmar aquest resultat mitjançant una altra línia cel·lular que expressava DARS-AS1, A549.Aquesta proliferació cel·lular millorada a causa de la sobreexpressió de DARS-AS1 es va observar encara més a les cèl·lules A549 (figura suplementària 2h, i i taula suplementària 3).En conjunt, aquests estudis de guanys i pèrdues demostren que DARS-AS1 promou la proliferació de cèl·lules canceroses in vitro.
Per explorar el mecanisme subjacent pel qual DARS-AS1 regula la proliferació cel·lular, vam realitzar una anàlisi desplegable d'ARN per identificar els seus potencials socis d'unió a proteïnes.Els resultats de RT-qPCR van mostrar que al voltant del 86, 2% de DARS-AS1 es troba al citoplasma de les cèl·lules SW620 (figura suplementària 3a).A continuació, el DARS-AS1 o pseudoRNA biotinilat transcrit in vitro es va incubar amb lisats de cèl·lules SW620 seguits de la separació SDS-PAGE.La tinció de plata posterior va demostrar que una banda diferent (~ 38 kDa) es va enriquir significativament en mostres d'extracció de DARS-AS1, però no en mostres d'ARN o perles simulades (Fig. 3a).Aquesta banda es va identificar com una proteïna activadora de PKR (PACT) per espectrometria de masses (MS) i es va confirmar encara més mitjançant immunoblotting en línies cel·lulars SW620, HCT116 i HepG2 (Fig. 3a, b).L'enriquiment de DARS i proteïnes PACT relacionades (PKR i TRBP) també es va investigar mitjançant l'anàlisi d'ARN mitjançant Western blotting (WB).Els resultats van indicar que no es va trobar cap interacció directa entre l'ARN DARS-AS1 i aquestes tres proteïnes (figura suplementària 3b).La interacció específica entre DARS-AS1 i PACT es va confirmar encara més mitjançant l'anàlisi d'immunoprecipitació d'ARN (RIP), que va demostrar que DARS-AS1 es va enriquir significativament en anticossos anti-PACT, però no en altres ARN de control (figura 3c).Per determinar si DARS-AS1 interacciona directament amb PACT en absència d'altres components cel·lulars, es va realitzar un assaig d'interferometria de biocapa (BLI) in vitro mitjançant PACT purificat.DARS-AS1 o ARN simulat marcat amb biotina es va immobilitzar en biosensors d'estreptavidina (SA) i després es va incubar en un tampó cinètic que contenia 1 μM de PACT.En particular, PACT es va unir fortament a DARS-AS1 (valor KD ~ 26, 9 nM), però no per imitar l'ARN (figura 3d).En conjunt, aquests resultats demostren una interacció directa i una alta afinitat entre DARS-AS1 i PACT.
L'anàlisi d'extracció d'ARN va identificar que DARS-AS1 interacciona amb PACT a les cèl·lules SW620.A dalt, tinció de plata de proteïnes relacionades.Es van realitzar immunoblots inferiors amb anticossos anti-PACT.b L'anàlisi desplegable d'ARN es va realitzar a les cèl·lules HCT116 (superior) i HepG2 (inferior).L'enriquiment de PACT es va detectar mitjançant immunoblot.Es van realitzar assajos d'immunoprecipitació d'ARNc (RIP) a cèl·lules SW620 mitjançant els anticossos indicats.d Les corbes d'unió de PACT a DARS-AS1 o ARN de control de longitud completa es van obtenir mitjançant interferometria de biocapa (BLI).L'ARN es va immobilitzar en un biosensor d'estreptavidina.Es va utilitzar 1 μM PACT per mesurar l'associació.L'assaig d'extracció d'ARN es va realitzar mitjançant DARS-AS1 de longitud completa biotinilada o truncat (a dalt).Immunoblot que mostra PACT rebut (a baix).f El PACT marcat purificat es va incubar amb DARS-AS1 de longitud completa biotinilada o es va truncar (com a e) per a un assaig RIP in vitro.L'ARN extret es va verificar mitjançant RT-qPCR.g L'afinitat relativa de diferents fragments d'ARN per PACT es va obtenir mitjançant interferometria de biocapa.Per a l'anàlisi, es van utilitzar ARN 100 nM i RAST 1 μM.h Els assajos RIP in vitro es van realitzar mitjançant PACT purificat intacte o truncat etiquetat.L'ARN extret es va verificar mitjançant RT-qPCR.i Taxa de creixement de cèl·lules SW620 que sobreexpressen DARS-AS1, PACT o ambdues.j La sobreexpressió de DARS-AS1 de longitud completa o truncada a les cèl·lules SW620 va tenir diferents efectes sobre el creixement cel·lular.k L'apoptosi es va detectar mitjançant immunoblot amb anticossos anti-PARP.l L'eliminació de DARS-AS1 indueix l'apoptosi de les cèl·lules SW620 tal com mostra la citometria de flux.Les dades mostrades són la mitjana ± desviació estàndard de tres experiments. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001, mitjançant la prova t de Student de dues cues. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001, mitjançant la prova t de Student de dues cues. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 mitjançant la prova t de Student de dues cues. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 mitjançant la prova t de Student de dues cues.
A continuació, vam generar tres fragments d'ARN DARS-AS1 biotinilats mitjançant transcripció in vitro per identificar la regió DARS-AS1 necessària per a l'associació PACT (figura 3e).Els resultats de l'anàlisi d'ARN van mostrar que cada fragment era capaç d'interaccionar amb PACT, però la regió 3′-terminal (384–768 nucleòtids marcats amb A3) mostrava més d'1–384 nucleòtids marcats amb A1) (Fig. 3e).Es van observar resultats similars en l'assaig RIP in vitro mitjançant PACT recombinant (figura 3f).D'acord amb aquests resultats, els experiments per unir fragments d'ARN immobilitzat a PACT mitjançant BLI també van demostrar que PACT té una afinitat més alta per A3 (384–768 nt) (valor KD d'aproximadament 94, 6 nM), mentre que gairebé no hi ha vincles amb altres àrees.(Fig. 3d).
També vam examinar les regions d'unió associades a PACT.PACT conté tres dominis funcionals, dos dels quals són dominis conservats d'unió a l'ARN de doble cadena (dsRBD) i un tercer domini (designat D3) que actua com a activador de les interaccions de proteïnes.Per examinar la capacitat d'unió de lncRNA de cada domini, vam dissenyar tres mutacions que van eliminar cadascun dels tres dominis i vam realitzar un assaig RIP in vitro.Els nostres resultats van mostrar que la supressió del tercer domini (D3) de PACT va reduir significativament la seva interacció amb DARS-AS1 (en 0,11 vegades en comparació amb PACT intacte) en comparació amb les altres dues mutacions (Fig. 3h), es va demostrar que l'alliberament de D3 va interactuar amb DARS.-AC1.En conjunt, aquests resultats suggereixen que la interacció entre DARS-AS1 i PACT es pot produir principalment a través de l'extrem 3' de DARS-AS1 i el domini D3 de PACT.
Vam observar que DARS-AS1 no va tenir cap efecte sobre l'expressió PACT i que PACT no va tenir cap efecte sobre DARS-AS1 (figura suplementària 3c).A continuació, vam examinar l'efecte de la derrota de PACT sobre el creixement cel·lular.A diferència del DARS-AS1, les cèl·lules relatives van créixer 1,5-3 vegades més ràpid quan es va enderrocar PACT (figura suplementària 3d).Els resultats de l'assaig de formació de colònies van indicar que les cèl·lules van formar colònies 2-3 vegades després del tractament amb shRNA amb PACT (figura suplementària 3e).Per provar si DARS-AS1 regula la proliferació cel·lular mitjançant PACT, vam generar cèl·lules SW620 que sobreexpressen PACT, DARS-AS1 o ambdues.La sobreexpressió de PACT va mostrar una inhibició significativa de la proliferació cel·lular (figura 3i).Tot i que la sobreexpressió de DARS-AS1 per se va promoure significativament la proliferació cel·lular, no hi va haver cap diferència significativa en la taxa de creixement de les cèl·lules que sobreexpressaven DARS-AS1 i PACT.Aquests resultats suggereixen que PACT pot contrarestar l'augment de la proliferació causada per la sobreexpressió de DARS-AS1.
Com que diferents regions de DARS-AS1 tenen diferents habilitats d'unió a PACT, vam investigar la seva influència relativa en la proliferació cel·lular mitjançant diferents sobreexpressió de fragments de DARS-AS1.En comparació amb els altres dos fragments, DARS-AS1 es va sobreexpressar a l'extrem 3' (384–768 nt), la principal regió relacionada amb PACT a DARS-AS1, que tenia la capacitat més alta per estimular la proliferació cel·lular (Fig. 3j).Aquests resultats indiquen una correlació positiva entre la capacitat d'unió i la funció biològica de DARS-AS1.
S'ha informat que PACT és una proteïna pro-apoptòtica19.Per tant, vam investigar l'efecte de DARS-AS1 sobre l'apoptosi.Com era d'esperar, la derrota de DARS-AS1 va augmentar significativament la divisió PARP a les cèl·lules SW620 i va augmentar la proporció de cèl·lules positives de l'annexina V a les línies cel·lulars SW620, HCT116, HepG2 i MBA-MD-231 (Fig. 3k).3).3f–h), cosa que indica que l'efecte anti-apoptòtic de DARS-AS1 a les cèl·lules canceroses és oposat a la funció induïdora d'apoptosi de PACT.En conjunt, aquests resultats suggereixen que el mecanisme de la funció oncogènica DARS-AS1 pot ser mitjançant la inhibició de la funció PACT.
A continuació, vam explorar les implicacions funcionals de l'associació DARS-AS1-PACT.S'ha informat que PACT activa PKR mitjançant la interacció directa, que posteriorment millora la fosforilació d'eIF2α, provocant la supressió de la traducció i l'apoptosi17.Primer, vam examinar si DARS-AS1 afecta la localització cel·lular de PACT i PKR.La microscòpia de fluorescència confocal va demostrar que PACT i PKR estaven altament colocalitzats a les cèl·lules SW620 amb un coeficient de correlació de Pearson mitjà de 0,72.Mentrestant, la sobreexpressió de DARS-AS1 va reduir significativament la colocalització de PACT i PKR (coeficient mitjà de correlació de Pearson 0, 61) (figura 4a).Per investigar si DARS-AS1 podria modular la interacció PACT-PKR, vam realitzar un assaig de co-immunoprecipitació (co-IP) amb anticossos anti-PACT en lisats de cèl·lules SW620.El PKR es va enriquir molt en anti-PACT a les cèl·lules control, mentre que la recuperació de PKR es va reduir significativament en els lisats de cèl·lules que sobreexpressaven DARS-AS1 (Fig. 4b).Es van utilitzar PACT i PKR marcats purificats per a assajos d'unió a proteïnes in vitro.En conseqüència, els que van proporcionar DARS-AS1 però cap ARN de control van mostrar una interacció PACT-PKR suprimida (figura 4c).Tots els resultats van mostrar que DARS-AS1 va interrompre la comunicació PACT i PKR.
es va observar una co-localització de PACT i PKR en cèl·lules de control o cèl·lules que sobreexpressen DARS-AS1 mitjançant microscòpia de fluorescència confocal.Els nuclis es van tenyir amb DAPI.Els resultats estadístics es van obtenir a partir de 16 fotografies.b Co-immunoprecipitació (co-IP) mitjançant anticossos anti-PACT en lisats cel·lulars de cèl·lules control SW620 o cèl·lules que sobreexpressen DARS-AS1.c Es van incubar PACT marcat, PKR purificat i transcrit in vitro amb DARS-AS1 o ARN simulat per a l'anàlisi d'unió a proteïnes in vitro.Es van utilitzar anticossos anti-bandera per a la immunoprecipitació.d Es van realitzar immunoblots amb els anticossos indicats en cèl·lules SW620 i HCT116 transfectades amb shRNA de control o DARS-AS1-shRNA seguits per inanició sèrica.Els nivells d'expressió DARS-AS1 van alterar la sensibilitat cel·lular a la thapsigargina.Les cèl·lules SW620 es van transfectar amb shRNA DARS-AS1, plasmidi de sobreexpressió DARS-AS1 o plasmidi de control.Les cèl·lules es van tractar amb thapsigargin durant 48 hores i es va determinar la viabilitat cel·lular mitjançant el reactiu MTS.f Es van utilitzar DARS-AS1 o ARN simulat transcrit in vitro i PACT purificat per a l'assaig d'activació in vitro i la detecció d'immunoblot.g Es van realitzar immunoblots amb aquests anticossos en cèl·lules SW620-ctrl (esquerra) o cèl·lules que sobreexpressaven mutants PKR (dreta).A continuació, aquestes cèl·lules es van transfectar amb shRNA de control o DARS-AS1-shRNA seguit d'inanició sèrica.h La citometria de flux va demostrar que la inactivació del PKR mutant compensava l'apoptosi induïda per DARS-AS1 a les cèl·lules SW620.i Es van realitzar immunoblots amb els anticossos indicats en cèl·lules SW620 (esquerra) o HCT116 (dreta).Les cèl·lules transfectades amb shRNA de control o shRNA DARS-AS1 estan privades de sèrum i es complementen amb 100 nM d'inhibidor de PKR C16 o DMSO.Barra d'escala = 5 µm.Les dades mostrades són la mitjana ± desviació estàndard de tres experiments.* p ≤ 0,05 Prova t de Student de dues cues.
En general, es creu que una vegada que PACT interacciona amb PKR17, es pot induir la fosforilació de PKR a Thr451.Els nostres resultats van indicar que el nivell de fosforilació de PKR es va elevar significativament a les cèl·lules derrocadores DARS-AS1 després de la fam de sèrum (figura 4d i figura suplementària 4a).En conseqüència, vam trobar que la fosforilació d'eIF2α, el principal substrat de PKR, també va augmentar significativament amb l'shRNA DARS-AS1 (figura 4d i figura suplementària 4a).La tapsigargina és un factor estressant del RE que fa que el RE alliberi Ca2+.S'ha informat que el tractament amb thapsigargina indueix l'expressió i l'activació de PACT, que interactua i activa encara més la PKR, donant lloc a l'apoptosi augmentant la fosforilació d'eIF2α 18,61.Aquí, hem utilitzat thapsigargina com a estimulador de la via PACT/PKR per investigar si DARS-AS1 pot ajudar les cèl·lules a superar l'estrès mitjançant la inhibició de la via PACT/PKR.Vam observar que el nivell d'expressió DARS-AS1 es correlacionava positivament amb la resistència cel·lular a la thapsigargina.Les cèl·lules SW620 que sobreexpressaven DARS-AS1 van sobreviure millor quan es van tractar amb thapsigargina, mentre que les cèl·lules amb derrocament de DARS-AS1 es van tornar més susceptibles (Fig. 4e).D'acord amb aquests resultats, la sobreexpressió DARS-AS1 va reduir la fosforilació de PKR induïda per thapsigargina (figura suplementària 4b).En canvi, després del tractament amb thapsigargin, PKR i eIF2α es van fosforilar en major mesura a les cèl·lules de derrota DARS-AS1 en comparació amb les cèl·lules de control (figura suplementària 4b).Curiosament, thapsigargin va induir l'expressió DARS-AS1 de manera dependent de la dosi, cosa que pot indicar una funció antiestrès de DARS-AS1 (figura suplementària 4c).A més, vam realitzar assajos d'activació in vitro per confirmar aquestes observacions.Breument, PKR es va purificar a partir de lisats cel·lulars mitjançant un anticòs anti-PKR, després es va incubar amb PACT recombinant i DARS-AS1 transcrit in vitro.Després de la reacció enzimàtica, es va detectar fosfo-PKR mitjançant WB.Els nostres resultats van indicar que DARS-AS1 va inhibir significativament la fosforilació de PKR, però no per l'ARN de control (figura 4f).Aquests resultats in vitro i in vivo suggereixen que DARS-AS1 inhibeix l'activació de PKR mediada per PACT.Al mateix temps, també vam observar una disminució de la recuperació de PACT en presència de DARS-AS1 (figura 4f).Aquest resultat és coherent amb els resultats de l'assaig d'unió a proteïnes in vitro (figura 4c) i torna a il·lustrar la funció de bloqueig de DARS-AS1 per a l'associació PACT-PKR.
Ser246 i Ser287 al domini D3 de PACT són necessaris per a l'activació de PKR sota estrès cel·lular.La substitució de dos residus de serina per alanina va donar PACT mutant (mutD), que va activar PKR en absència d'estrès, i la substitució per alanina (mutA) va invertir el protocol.Com que hem demostrat la importància d'aquest domini en associació directa amb DARS-AS1, vam generar aquests dos mutants PACT per provar si aquests residus també podrien estar implicats en la interacció amb DARS-AS1.Curiosament, ambdós mutants van perdre la capacitat d'unir-se a DARS-AS1 (figura suplementària 4d), cosa que suggereix que l'estructura completa de la proteïna PACT pot ser necessària per a una interacció eficient amb DARS-AS1.
A més, els nostres resultats també suggereixen que la inhibició de la proliferació cel·lular induïda per DARS-AS1-shRNA es pot restaurar parcialment sobreexpressant un mutant PACT negatiu dominant (PACTmutA) o un mutant PKR negatiu dominant (PKRmut) (figura suplementària 4e. e).La sobreexpressió de mutants PKR dominants negatius va reduir la fosforilació de PKR induïda per la derrota de DARS-AS1, així com la fosforilació d'eIF2α en cèl·lules privades de sèrum (Fig. 4g).Més important encara, la proporció de cèl·lules apoptòtiques induïdes per la derrota de DARS-AS1 també es va reduir a les cèl·lules que sobreexpressaven PKRmut (figura 4h i figura suplementària 4g).La inhibició de l'activitat de la quinasa PKR també perjudica la funció de DARS-AS1, ja que els resultats van demostrar que la derrota de DARS-AS1 rarament va desencadenar la fosforilació de PKR i eIF2α quan les cèl·lules es van tractar amb un inhibidor C16 específic de PKR (figura 4i i figura suplementària 4h).).En conjunt, els nostres resultats suggereixen que DARS-AS1 promou la proliferació cel·lular, almenys en part, mitjançant la inhibició de l'activació de PKR mediada per PACT.
Per explorar més el paper de DARS-AS1 en la tumorigènesi, vam realitzar experiments in vivo mitjançant un model de xenograft de ratolí. Els resultats mostren que la derrota de DARS-AS1 va disminuir dràsticament el creixement del tumor en ratolins (valor de p <0, 0001) (Fig. 5a). Els resultats mostren que la derrota de DARS-AS1 va disminuir dràsticament el creixement del tumor en ratolins (valor de p <0, 0001) (Fig. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значера ни 0 p. 15). Els resultats mostren que la derrota de DARS-AS1 redueix dràsticament el creixement del tumor en ratolins (valor de p <0, 0001) (figura 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей мышей (значительно снижает рост опухоли у мышей) (значительно снижает). Els resultats van mostrar que la derrota de DARS-AS1 va reduir significativament el creixement del tumor en ratolins (valor de p <0, 0001) (figura 5a).Així, al grup de derrota DARS-AS1, hi va haver una disminució significativa del volum mitjà del tumor en un 72, 9% i la massa tumoral mitjana d'un 87, 8% (figura 5b-d).Aquests resultats suggereixen fortament que DARS-AS1 pot promoure significativament el creixement del tumor in vivo.
Efectes de la derrota de l'anunci DARS-AS1 sobre l'oncogènesi colorectal en ratolins nus.Es mostren les corbes de creixement (a), la mida del tumor (b), el pes (c) i les imatges del tumor (d).Les barres d'error representen ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, mitjançant la prova t de Student de dues cues. n = 10. ****p < 0,0001, mitjançant la prova t de Student de dues cues. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 Prova t de Student de dues cues.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 Prova t de Student de dues cues.e Kaplan-Meier va analitzar la correlació entre els nivells d'expressió DARS-AS1 i la supervivència global en pacients amb UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM i LGG.Els alts nivells d'expressió DARS-AS1 en pacients es trobaven en el 50% superior;el baix nivell d'expressió DARS-AS1 en pacients es trobava en el 50% inferior.Els valors p es van determinar mitjançant la prova de rang de registre.f Model proposat en el qual DARS-AS1 regula la via PACT-PKR i el creixement del tumor.
Per entendre millor l'impacte clínic de DARS-AS1, vam examinar la correlació entre la seva expressió i la supervivència del pacient.Mitjançant l'anàlisi del conjunt de dades TCGA, vam trobar que una expressió DARS-AS1 més alta es va associar amb melanoma uveal (UVM), cromofòbia renal (KICH), carcinoma de cèl·lules papil·lars renals (KIRP), mesotelioma (MESO), múltiplex.La menor supervivència es va associar significativament amb la morfosi del glioblastoma (GBM) i els pacients amb glioma cerebral de baix grau (LGG) (figura 5e).Aquests resultats suggereixen que DARS-AS1 pot tenir un paper important en la progressió clínica del tumor i pot ser un biomarcador predictiu potencial en múltiples càncers.
En aquest estudi, utilitzant el cribratge funcional CRISPRi a gran escala, vam determinar que el lncRNA DARS-AS1 supera l'estrès de les cèl·lules canceroses mitjançant la regulació de dos responents clau a l'estrès, PACT i PKR.En interactuar directament amb PACT, DARS-AS1 va inhibir l'activació de PKR mediada per PACT, prevenint així la mort cel·lular apoptòtica i afavorint la proliferació cel·lular (Fig. 5f).S'ha observat una regulació positiva de DARS-AS1 en múltiples tipus de càncer, cosa que suggereix que la seva funció de promoure la supervivència de les cèl·lules canceroses en condicions estressants pot ser àmpliament aplicable a múltiples tipus de càncer.
PACT s'ha identificat com una proteïna activadora de PKR i l'activació de PKR mediada per PACT té un paper important en les respostes a l'estrès mitjançant la regulació de la transcripció, la traducció, l'apoptosi i altres processos cel·lulars importants62.Durant dècades, s'han intentat entendre la regulació específica del càncer de la cascada PACT-PKR.Aquí, el nostre estudi va revelar un mecanisme diferent de regulació de PACT-PKR a les cèl·lules canceroses mitjançant lncRNA cel·lular DARS-AS1, que s'uneix directament a PACT, bloqueja la interacció PACT-PKR, inhibeix l'activació de PKR i la fosforilació d'eIF2α, inhibint així l'apoptosi induïda per l'estrès i estimulant la proliferació eventual del càncer.cèl · lules.Aquest descobriment fa llum sobre els objectius potencials de lncRNA per al pronòstic i la teràpia del càncer.
Les nostres dades van demostrar que la derrota de DARS-AS1 sensibilitza les cèl·lules a la fam de sèrum amb un augment significatiu de la PKR fosforilada i eIF2α.Aquests resultats suggereixen que DARS-AS1 promou la supervivència de les cèl·lules canceroses en condicions dures mitjançant la inhibició de l'activitat PACT/PKR.Diversos altres ARN no codificants, com ASPACT i nc886, també estan implicats en l'eix PACT/PKR regulant a la baixa l'ARNm de PACT48 o regulant l'autofosforilació unint-se a PKR49,50,64.Entre ells, DARS-AS1 actua com a disruptor de l'associació PACT-PKR.Aquest estudi enriqueix la nostra comprensió de la regulació de l'eix PACT/PKR i el paper dels lncRNAs en les respostes a l'estrès.
PACT conté tres dominis separats.Cadascun dels dos primers dsRBD és suficient per aconseguir una alta afinitat d'unió de PACT a PKR, mentre que el tercer domini (D3) és necessari per a l'activació de PKR in vitro i in vivo.El nostre estudi va demostrar que DARS-AS1 interacciona preferentment amb el domini D3 (Fig. 3h).Donada la gran mida del lncRNA (768 nucleòtids), la unió de DARS-AS1 a D3 pot inhibir físicament la interacció entre el domini PACT de dsRBD i PKR, bloquejant així l'associació de PACT i PKR.Les mutacions puntuals PACT que van substituir Ser246 i Ser287 a D3 per alanina o aspartat van interrompre la seva afinitat d'unió per DARS-AS1, assenyalant la importància de les propietats elèctriques i estructurals globals de D3 en la seva associació.Es requeriran més detalls d'aquest mecanisme en el futur, utilitzant anàlisis bioquímiques més precises i anàlisis estructurals PACT d'alta resolució.
Estudis anteriors han informat que DARS-AS1 promou la proliferació cel·lular mitjançant diversos mecanismes51,52,53.En un exemple, els investigadors van observar que DARS-AS1 va augmentar el seu gen DARS que codificava proteïnes antisentit dirigint-se a miP-194-5p a les cèl·lules de càncer de ronyó.Tanmateix, en el present estudi, la derrota de DARS-AS1 va tenir poc efecte en la transcripció de DARS en diversos tipus de càncer, inclosos almenys els càncers colorectal, de mama i de fetge.Com que els lncRNA presenten patrons d'expressió específics de cèl·lules i teixits, és possible que els mecanismes funcionals no es conserven entre els tipus de càncer, cosa que pot contribuir a aquesta discrepància entre les nostres observacions i avaluacions anteriors de diferents càncers.Es necessiten estudis especials per dilucidar els mecanismes específics de diversos processos fisiològics i patològics.
Una anàlisi de dades clíniques va mostrar que l'expressió DARS-AS1 en tumors està inversament correlacionada amb la supervivència dels pacients amb càncer, cosa que subratlla la importància de l'eix DARS-AS1/PACT/PKR en el pronòstic del càncer.En conclusió, el nostre estudi mostra que DARS-AS1 és un regulador de l'eix de senyalització PACT/PKR, promou la proliferació de cèl·lules canceroses i inhibeix l'apoptosi durant la resposta a l'estrès, la qual cosa proporciona una altra línia d'investigació i és d'interès per a futures investigacions sobre possibles tractaments. .
Les línies cel·lulars humanes SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 i HEK293T es van obtenir de la National Cell Line Resource Infrastructure a la Xina.Totes les cèl·lules es van mantenir en medi DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) complementat amb 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) i 1% penicil·lina-estreptomicina (Thermo Fisher Scientific) a 37 ° C, 5% CO2.incubadora.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Antibandera, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fòsfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fòsfor S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulina, CST (2128);IgG normal de ratolí, CST (5415S);IgG normal de conill, CST (2729S).Els anticossos es van diluir 1:1000 en PBST per Western blotting i 1:100 per IP.
Els sgRNA es van desenvolupar mitjançant una eina disponible públicament anomenada CRISPR-ERA66.Hem utilitzat els paràmetres per defecte de l'eina per al desenvolupament de sgRNA i l'algoritme va calcular els llocs d'unió de sgRNA a la regió de 3 kb.centrat en TSS.Es van sintetitzar grups d'oligonucleòtids sgRNA a CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) i es van clonar en plasmidis pgRNA humanitzats (Addgene #44248).Un total de 12 µg de plasmidi pgRNA humanitzat agrupat, 7,2 µg de psPAX2 (Addgene #12260) i 4,8 µg de pMD2.G (Addgene #12259) es van co-transfectar en 5 x 106 HEK293T en un plat de transfeccions d'ADN de 10 cm. cel·les (CWBIO, Beijing, Xina) seguint les instruccions del fabricant.Els sobrenedants que contenen virus es van recollir 48 i 72 hores després de la transfecció i es van filtrar a través d'un filtre de 0,45 µm.Per al cribratge, es van obtenir cèl·lules SW620 que expressaven la proteïna de fusió dCas9/KRAB mitjançant transducció de virus.Les cèl·lules SW620 modificades es van infectar amb la biblioteca de virus en quatre experiments d'infecció independents a un MOI de 0,1-0,3 i es van mostrejar amb 2 μg/ml de puromicina (Sigma, St. Louis, MO) durant 2 dies.A continuació, es van cultivar cèl·lules durant 18 dies in vitro amb una cobertura mínima de la biblioteca de 500 cèl·lules/sgRNA per al cribratge.
L'ADN genòmic es va extreure segons les instruccions del kit QIAamp DNA Blood Midi (QIAGEN, Düsseldorf, Alemanya; 51183).En total, es van utilitzar 100 μg d'ADN genòmic per repetició biològica per construir la biblioteca.La regió sgRNA es va amplificar amb dues rondes de PCR i es va enllaçar a un codi de barres.
Els productes de PCR es van purificar mitjançant el gel NucleoSpin® i el kit de purificació de PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Alemanya; 740609.250) i es van quantificar mitjançant el kit de detecció d'ADN de doble cadena Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
El test MTS es va utilitzar per mesurar la proliferació cel·lular.Les cèl·lules es van sembrar en plaques de 96 pous a una densitat inicial de 2000 cèl·lules/pou.El nombre relatiu de cèl·lules es va mesurar diàriament a l'hora indicada durant un total de 4-6 dies.Per a cada pou, es van diluir 20 μl de reactiu MTS (Promega) amb 100 μl de DMEM, es van incubar amb cèl·lules durant 4 h a 37 ° C i després es va mesurar OD490.
La capacitat de creixement no ancorat es va descobrir analitzant la formació d'esferes.Breument, es van cultivar 2000 cèl·lules transfectades amb shRNA DARS-AS1 o shRNA de control en microplaques d'unió ultra baixa (Corning) amb canvi de mitjà cada 4 dies.Els esferoides es van comptar després de 14 dies.Es van utilitzar 500 cèl·lules transfectades amb el plasmidi de sobreexpressió DARS-AS1 o un plasmidi de control per a l'assaig de millora, en cas contrari, el mètode no va canviar.
L'ARN es va transcriure mitjançant ARN polimerasa T7 i biotina-16-UTP (Roche 1138908910) segons les instruccions de Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Els imprimadors utilitzats aquí s'enumeren a la taula complementària 4.
Les regions PACT o PKR que codificaven proteïnes es van clonar a pET15b (Addgene #73619) i es van transformar en BL21 (DE3).Els bacteris es van incubar durant la nit en LB subministrat amb ampicil·lina i després es van diluir 100 vegades amb LB fresc.Quan la OD600 del medi va arribar a 0, 8, es va afegir 1 mM d'IPTG per induir l'expressió de proteïnes.Després de la incubació durant la nit amb agitació suau (250 rpm a 20 ° C), el pellet cel·lular es va recollir per centrifugació (4000 rpm, 10 min, 4 ° C).Resuspendre el pellet cel·lular en tampó de lisi (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) i incubar en gel durant 30 min, després sonicar (15 min, 5 s on/off, en gel) i centrifugar (13.000 rpm)., 30 min, 4°С).El sobrenedant es va carregar a la resina Ni-NTA (QIAGEN) 3 vegades a 4 °C, es va rentar 4 vegades amb tampó de rentat (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazol, 250 mM NaCl) i es va eluir 3 vegades, amb un total de 10 ml de tampó eluent (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 250 mM, imidazol 300 mM).La proteïna purificada es va determinar mitjançant WB i la concentració es va determinar mitjançant el kit d'assaig de proteïnes Qubit ™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Els assajos RIP es van realitzar tal com es va descriure anteriorment, amb modificacions.Breument, 1 tampó RIP (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, inhibidor de RNasin ribonucleasa (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteasa) lisa còctel citostàtic 1 x 107 (Roche, 1 mM DTT) i centrifugar a 13.000 rpm durant 15 min a 4 ° C.A continuació, el sobrenedant es va incubar amb perles magnètiques de proteïna A + G (Millipore) conjugada amb 5 μg d'anticossos anti-PACT (Abeam) o IgG (CST).Les perles es van rentar 5 vegades amb tampó RIP 5x i després es van digerir amb proteïnasa K (NEB).L'ARN es va extreure amb Trizol i es va determinar mitjançant RT-qPCR.Els primers es presenten a la taula complementària 5.
L'assaig RIP in vitro es va realitzar segons un protocol d'assaig RIP estàndard modificat.Es van diluir un total de 5 pmol d'ARN transcrit in vitro 1x amb tampó RIP i es van recuit per incubació a 65 ° C durant 5 minuts seguit d'un refredament lent a temperatura ambient.Es van purificar un total de 5 pmol de proteïnes PACT marcades amb bandera intactes o mutades d'E. coli.Incubeu amb ARN renaturalitzat durant 2 hores a 4 ° C i seguiu el procediment anterior per a l'anàlisi RIP per IP anti-bandera.
Per a l'anàlisi d'extensió d'ARN, es van lisar 1 × 107 cèl·lules amb tampó 1xRIP.Després de la centrifugació a 13.000 rpm durant 15 min a 4 ° C, el sobrenedant es va pretractar amb 30 μl de perles magnètiques d'estreptavidina (Beckman) durant 2 h a 4 ° C.A continuació, es va subministrar el lisat purificat amb tRNA de llevat i es va incubar amb 40 pmol d'ARN renaturalitzat durant la nit a 4 ° C, després durant 2 hores més i es van afegir 20 μl de noves perles magnètiques d'estreptavidina bloquejades amb BSA.El pas de rentat va consistir en 4 vegades amb 5x tampó RIP i 4 vegades amb 1x tampó RIP.Les proteïnes corresponents es van eluir amb tampó d'elució de biotina (25 mM Tris-HCl, pH 7, 5, 12, 5 mM D-biotina, PMSF) i es van separar en NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Després de la tinció de plata (Beyotime Biotechnology), determinades bandes van ser extirpades i analitzades per MS.
Es va realitzar una anàlisi Co-IP per provar la interacció entre PACT i PKR.Breument, els lisats sobrenedants es van preparar incubant 1 x 107 cèl·lules lisades en 1 x tampó RIP seguit de centrifugació a 13.000 rpm durant 15 minuts a 4 ° C.Els lisats es van carregar amb perles magnètiques de proteïna A + G, es van conjugar amb 5 µg d'anticossos anti-PACT i es van girar suaument durant la nit a 4 ° C.Les perles es van rentar 3 vegades amb tampó 5 × RIP, dues vegades amb tampó 1 × RIP i es van eluir amb 1 × tampó SDS.La proteïna recuperada es va analitzar amb gel SDS-PAGE i es va detectar per WB.
Es van purificar dos pmol de PACT marcat i 1 pmol de PKR d'E. coli.Diluir en tampó RIP 1 × i incubar amb 10 pmol d'ARN renaturalitzat durant 2 hores a 4 ° C.Després d'això, es van incubar amb anticossos anti-etiquetatge conjugat amb perles magnètiques de proteïna A + G durant dues hores addicionals.Les perles es van rentar quatre vegades amb 1x tampó RIP i es van eluir amb 1x tampó SDS.El PACT i PKR resultants van ser detectats per WB.
Hora de publicació: 23-set-2022
