Gràcies per visitar Nature.com.La versió del navegador que utilitzeu té un suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).Mentrestant, per garantir un suport continuat, renderitzarem el lloc sense estils ni JavaScript.
Els fotosensibilitzadors efectius són especialment importants per a l'ús clínic generalitzat de la fototeràpia.Tanmateix, els fotosensibilitzadors convencionals pateixen generalment una absorció de longitud d'ona curta, una fotoestabilitat insuficient, un baix rendiment quàntic d'espècies reactives d'oxigen (ROS) i una extinció de ROS induïda per l'agregació.Aquí informem d'un fotosensibilitzador supramolecular (RuDA) d'infraroig proper (NIR) mediat per l'autoassemblatge de complexos organometàl·lics de Ru (II)-aren en solució aquosa.RuDA només pot generar oxigen singlet (1O2) en estat agregat i presenta un comportament de generació d'1O2 induït per l'agregació evident a causa d'un augment significatiu del procés d'encreuament entre el sistema singlet-triplet.Sota l'acció de la llum làser de 808 nm, RuDA presenta un rendiment quàntic d'1O2 del 16,4% (verd d'indocianina aprovat per la FDA: ΦΔ=0,2%) i una alta eficiència de conversió fototèrmica del 24,2% (nanorods d'or comercials) amb una excel·lent fotoestabilitat.: 21,0%, nanoshells d'or: 13,0%).A més, els RuDA-NP amb bona biocompatibilitat poden acumular-se preferentment als llocs del tumor, provocant una regressió tumoral significativa durant la teràpia fotodinàmica amb una reducció del 95, 2% del volum del tumor in vivo.Aquesta teràpia fotodinàmica que millora l'agregació proporciona una estratègia per desenvolupar fotosensibilitzants amb propietats fotofísiques i fotoquímiques favorables.
En comparació amb la teràpia convencional, la teràpia fotodinàmica (PDT) és un tractament atractiu per al càncer a causa dels seus avantatges significatius com ara un control espai-temporal precís, no invasivitat, resistència insignificant als medicaments i minimització dels efectes secundaris 1,2,3.Sota irradiació lumínica, els fotosensibilitzadors utilitzats es poden activar per formar espècies d'oxigen altament reactives (ROS), donant lloc a apoptosi/necrosi o respostes immunes4,5. No obstant això, la majoria dels fotosensibilitzadors convencionals, com els clors, les porfirines i les antraquinones, tenen una absorció de longitud d'ona relativament curta (freqüència < 680 nm), donant lloc a una mala penetració de la llum a causa de la intensa absorció de molècules biològiques (per exemple, hemoglobina i melanina) en la regió visible6,7. No obstant això, la majoria dels fotosensibilitzadors convencionals, com els clors, les porfirines i les antraquinones, tenen una absorció de longitud d'ona relativament curta (freqüència < 680 nm), donant lloc a una mala penetració de la llum a causa de la intensa absorció de molècules biològiques (per exemple, hemoglobina i melanina) en la regió visible6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. No obstant això, els fotosensibilitzadors més comuns com els clors, les porfirines i les antraquinones tenen una absorció de longitud d'ona relativament curta (< 680 nm) que resulta en una mala penetració de la llum a causa de l'absorció intensa de molècules biològiques (per exemple, hemoglobina i melanina) a la regió visible6,7.然而 ， 大多数 传统 的 光敏剂 ， 如 二 氢 卟酚 、 卟啉.导致光穿透性差。然而 ， 大多数 传统 的 光敏剂 ， 二 氢 卟酚 、 卟啉 ， 具有 相对 较 短 的 波长 吸收 （（"吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI 导致光穿透性差。 Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. No obstant això, la majoria dels fotosensibilitzadors tradicionals com els clors, les porfirines i les antraquinones tenen una absorció de longitud d'ona relativament curta (freqüència < 680 nm) a causa de la forta absorció de biomolècules com l'hemoglobina i la melanina que resulta en una mala penetració de la llum.Àrea visible 6.7.Per tant, els fotosensibilitzadors que absorbeixen l'infraroig proper (NIR) que s'activen a la "finestra terapèutica" de 700-900 nm són molt adequats per a la fototeràpia.Com que la llum infraroja propera és la menys absorbida pels teixits biològics, pot provocar una penetració més profunda i menys danys fotogràfics8,9.
Malauradament, els fotosensibilitzadors que absorbeixen NIR existents generalment tenen una poca fotoestabilitat, una baixa capacitat de generació d'oxigen singlet (1O2) i una extinció d'1O2 induïda per l'agregació, cosa que limita la seva aplicació clínica10,11.Tot i que s'han fet grans esforços per millorar les propietats fotofísiques i fotoquímiques dels fotosensibilitzadors convencionals, fins ara diversos informes han informat que els fotosensibilitzadors que absorbeixen NIR poden resoldre tots aquests problemes.A més, diversos fotosensibilitzadors han demostrat ser prometedors per a la generació eficient d'1O212,13,14 quan s'irradien amb llum per sobre de 800 nm, ja que l'energia fotònica disminueix ràpidament a la regió propera a l'IR.Trifenilamina (TFA) com a donant d'electrons i [1,2,5]tiadiazol-[3,4-i]dipirido[a,c]fenazina (TDP) com a grup acceptor d'electrons Tipus de colorants donant-acceptador (DA) d'una classe de colorants, que absorbeixen l'infraroig proper, que s'han estudiat àmpliament per a la bioimatge d'infrarojos propers II i la teràpia fototèrmica (PTT) a causa de la seva banda intercalada estreta.Així, els colorants de tipus DA es poden utilitzar per a PDT amb excitació propera a IR, tot i que poques vegades s'han estudiat com a fotosensibilitzadors per a PDT.
És ben sabut que l'alta eficiència de l'encreuament entre sistemes (ISC) dels fotosensibilitzadors afavoreix la formació d'1O2.Una estratègia comuna per avançar en el procés ISC és millorar l'acoblament gir-òrbita (SOC) dels fotosensibilitzadors mitjançant la introducció d'àtoms pesats o fragments orgànics especials.Tanmateix, aquest enfocament encara té alguns inconvenients i limitacions19,20.Recentment, l'autoassemblatge supramolecular ha proporcionat un enfocament intel·ligent de baix a dalt per a la fabricació de materials funcionals a nivell molecular,21,22 amb nombrosos avantatges en fototeràpia: (1) els fotosensibilitzadors autoassemblats poden tenir el potencial de formar estructures de cintes.Similar a les estructures electròniques amb una distribució més densa dels nivells d'energia a causa de les òrbites superposades entre els blocs de construcció.Per tant, es millorarà la concordança energètica entre l'estat excitat del singlet inferior (S1) i l'estat excitat del triplet veí (Tn), cosa que és beneficiós per al procés ISC 23, 24.(2) El muntatge supramolecular reduirà la relaxació no radiativa basada en el mecanisme de limitació del moviment intramolecular (RIM), que també promou el procés ISC 25, 26.(3) El conjunt supramolecular pot protegir les molècules internes del monòmer de l'oxidació i la degradació, millorant així molt la fotoestabilitat del fotosensibilitzador.Tenint en compte els avantatges anteriors, creiem que els sistemes fotosensibilitzadors supramoleculars poden ser una alternativa prometedora per superar les deficiències de la PDT.
Els complexos basats en Ru(II) són una plataforma mèdica prometedora per a aplicacions potencials en el diagnòstic i la teràpia de malalties a causa de les seves propietats biològiques úniques i atractives28,29,30,31,32,33,34.A més, l'abundància d'estats excitats i les propietats fotofísicoquímiques ajustables dels complexos basats en Ru (II) proporcionen grans avantatges per al desenvolupament de fotosensibilitzadors basats en Ru (II)35,36,37,38,39,40.Un exemple notable és el complex polipiridil de ruteni (II) TLD-1433, que actualment es troba en assaigs clínics de fase II com a fotosensibilitzant per al tractament del càncer de bufeta no invasiu muscular (NMIBC)41.A més, els complexos organometàl·lics de ruteni (II) arè s'utilitzen àmpliament com a agents quimioterapèutics per al tractament del càncer a causa de la seva baixa toxicitat i facilitat de modificació42,43,44,45.Les propietats iòniques dels complexos organometàl·lics de Ru (II)-areno no només poden millorar la poca solubilitat dels cromòfors DA en dissolvents comuns, sinó que també poden millorar el muntatge dels cromòfors DA.A més, l'estructura semi sandvitx pseudooctaèdrica dels complexos organometàl·lics de Ru (II)-arenes pot prevenir estèricament l'agregació H de cromòfors de tipus DA, facilitant així la formació d'agregació J amb bandes d'absorció desplaçades al vermell.Tanmateix, els desavantatges inherents dels complexos Ru (II)-aren, com ara una baixa estabilitat i/o una mala biodisponibilitat, poden afectar l'eficàcia terapèutica i l'activitat in vivo dels complexos arene-Ru (II).Tanmateix, els estudis han demostrat que aquests inconvenients es poden superar encapsulant complexos de ruteni amb polímers biocompatibles mitjançant encapsulació física o conjugació covalent.
En aquest treball, informem de complexos conjugats amb DA de Ru (II)-arene (RuDA) amb un disparador NIR mitjançant un enllaç de coordinació entre el cromòfor DAD i el fragment Ru (II)-arene.Els complexos resultants es poden autoensamblar en vesícules metalosupramoleculars a l'aigua a causa d'interaccions no covalents.En particular, el conjunt supramolecular va dotar a RuDA de propietats d'encreuament entre sistemes induïdes per polimerització, que van augmentar significativament l'eficiència de l'ISC, que era molt favorable per a la PDT (Fig. 1A).Per augmentar l'acumulació de tumors i la biocompatibilitat in vivo, es va utilitzar Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) aprovat per la FDA per encapsular RuDA47,48,49 per crear nanopartícules RuDA-NP (figura 1B) que actuaven com a PDT / Dual-altament eficient. mode proxy PTT.En la fototeràpia del càncer (figura 1C), RuDA-NP es va utilitzar per tractar ratolins nus amb tumors MDA-MB-231 per estudiar l'eficàcia de la PDT i la PTT in vivo.
Il·lustració esquemàtica del mecanisme fotofísic de RuDA en formes monomèriques i agregades per a la fototeràpia del càncer, síntesi de B RuDA-NP i C RuDA-NP per a PDT i PTT activats per NIR.
RuDA, que consisteix en la funcionalitat TPA i TDP, es va preparar segons el procediment que es mostra a la figura suplementària 1 (figura 2A), i RuDA es va caracteritzar per espectres de RMN 1H i 13C, espectrometria de masses d'ionització electrospray i anàlisi elemental (figures suplementàries 2-4). ).El mapa de diferències de densitat d'electrons RuDA de la transició singlet més baixa es va calcular mitjançant la teoria funcional de la densitat dependent del temps (TD-DFT) per estudiar el procés de transferència de càrrega.Com es mostra a la figura suplementària 5, la densitat d'electrons deriva principalment de la trifenilamina a la unitat acceptora de TDP després de la fotoexcitació, que es pot atribuir a una transició típica de transferència de càrrega intramolecular (CT).
Estructura química del mineral B Espectres d'absorció del mineral en mescles de diverses proporcions de DMF i aigua.C Valors d'absorció normalitzats de RuDA (800 nm) i ICG (779 nm) en funció del temps a 0,5 W cm-2 de llum làser de 808 nm.D La fotodegradació d'ABDA s'indica per la formació induïda per RuDA d'1O2 en mescles DMF/H2O amb diferents continguts d'aigua sota l'acció de la radiació làser amb una longitud d'ona de 808 nm i una potència de 0,5 W/cm2.
Resum: es va utilitzar l'espectroscòpia d'absorció UV-visible per estudiar les propietats d'autoassemblatge del mineral en mescles de DMF i aigua en diverses proporcions.Com es mostra a la fig.2B, RuDA presenta bandes d'absorció de 600 a 900 nm en DMF amb una banda d'absorció màxima a 729 nm.L'augment de la quantitat d'aigua va provocar un desplaçament al vermell gradual del màxim d'absorció de mineral fins a 800 nm, cosa que indica l'agregació de mineral en J al sistema muntat.Els espectres de fotoluminescència de RuDA en diferents dissolvents es mostren a la figura suplementària 6. Sembla que RuDA presenta una luminescència NIR-II típica amb una longitud d'ona d'emissió màxima de ca.1050 nm en CH2Cl2 i CH3OH, respectivament.El gran desplaçament de Stokes (uns 300 nm) de RuDA indica un canvi significatiu en la geometria de l'estat excitat i la formació d'estats excitats de baixa energia.Es va determinar que els rendiments quàntics de luminescència del mineral en CH2Cl2 i CH3OH eren del 3,3 i del 0,6%, respectivament.No obstant això, en una barreja de metanol i aigua (5/95, v/v), es va observar un lleuger desplaçament cap al vermell de l'emissió i una disminució del rendiment quàntic (0,22%), que pot ser degut a l'autoassemblatge del mineral. .
Per visualitzar l'autoassemblatge d'ORE, hem utilitzat la microscòpia de força atòmica líquida (AFM) per visualitzar els canvis morfològics de l'ORE en solució de metanol després d'afegir aigua.Quan el contingut d'aigua era inferior al 80%, no es va observar cap agregació clara (figura suplementària 7).No obstant això, amb un augment més del contingut d'aigua fins al 90-95%, van aparèixer petites nanopartícules, que indicaven l'autoassemblatge de Ore. A més, la irradiació làser amb una longitud d'ona de 808 nm no va afectar la intensitat d'absorció de RuDA en aigua aquosa. solució (Fig. 2C i Fig. 8 suplementària).En canvi, l'absorbància del verd indocianina (ICG com a control) va baixar ràpidament a 779 nm, cosa que indica una excel·lent fotoestabilitat de RuDA.A més, es va examinar l'estabilitat de RuDA-NP en PBS (pH = 5, 4, 7, 4 i 9, 0), 10% FBS i DMEM (glucosa alta) mitjançant espectroscòpia d'absorció UV-visible en diversos moments.Tal com es mostra a la figura suplementària 9, es van observar lleugers canvis en les bandes d'absorció de RuDA-NP a PBS a pH 7,4/9,0, FBS i DMEM, cosa que indica una excel·lent estabilitat de RuDA-NP.Tanmateix, en un medi àcid (рН = 5,4) es va trobar hidròlisi del mineral.També vam avaluar més l'estabilitat de RuDA i RuDA-NP mitjançant mètodes de cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC).Tal com es mostra a la figura suplementària 10, RuDA va ser estable en una barreja de metanol i aigua (50/50, v/v) durant la primera hora i es va observar hidròlisi després de 4 hores.Tanmateix, només es va observar un ampli pic còncau-convex per als NP RuDA.Per tant, es va utilitzar la cromatografia de permeació en gel (GPC) per avaluar l'estabilitat dels RuDA NPs en PBS (pH = 7, 4).Tal com es mostra a la figura suplementària 11, després de 8 hores d'incubació en les condicions provades, l'alçada del pic, l'amplada del pic i l'àrea del pic de NP RuDA no van canviar significativament, cosa que indica una excel·lent estabilitat de NP RuDA.A més, les imatges TEM van mostrar que la morfologia de les nanopartícules RuDA-NP es va mantenir pràcticament sense canvis després de 24 hores en tampó PBS diluït (pH = 7, 4, figura suplementària 12).
Com que l'autoassemblatge pot conferir diferents característiques funcionals i químiques a Ore, vam observar l'alliberament d'àcid 9,10-antracèdiilbis(metilen)dimalònic (ABDA, indicador 1O2) en mescles metanol-aigua.Mena amb diferent contingut d'aigua50.Com es mostra a la figura 2D i a la figura suplementària 13, no es va observar cap degradació d'ABDA quan el contingut d'aigua era inferior al 20%.Amb un augment de la humitat fins al 40%, es va produir la degradació de l'ABDA, com ho demostra una disminució de la intensitat de la fluorescència ABDA.També s'ha observat que un contingut d'aigua més elevat provoca una degradació més ràpida, cosa que suggereix que l'autoassemblatge de RuDA és necessari i beneficiós per a la degradació d'ABDA.Aquest fenomen és molt diferent dels cromòfors ACQ (apagament induït per agregació) moderns.Quan s'irradia amb un làser amb una longitud d'ona de 808 nm, el rendiment quàntic d'1O2 RuDA en una barreja de 98% H2O/2% DMF és del 16,4%, que és 82 vegades més gran que el de ICG (ΦΔ = 0,2%)51, demostrant una notable eficiència de generació de 1O2 RuDA en estat d'agregació.
Spins d'electrons que utilitzen 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidinona (TEMP) i 5,5-dimetil-1-pirrolina N-òxid (DMPO) com a trampes de spin L'espectroscòpia de ressonància (ESR) es va utilitzar per identificar les espècies resultants AFK.per RuDA.Com es mostra a la figura suplementària 14, s'ha confirmat que es genera 1O2 en temps d'irradiació entre 0 i 4 minuts.A més, quan RuDA es va incubar amb DMPO sota irradiació, es va detectar un senyal típic d'EPR de quatre línies d'adducte DMPO-OH· 1:2:2:1, que indica la formació de radicals hidroxil (OH·).En general, els resultats anteriors demostren la capacitat de RuDA per estimular la producció de ROS mitjançant un procés de fotosensibilització dual tipus I/II.
Per entendre millor les propietats electròniques de RuDA en formes monomèriques i agregades, es van calcular els orbitals moleculars de frontera de RuDA en formes monomèriques i dimèriques mitjançant el mètode DFT.Com es mostra a la fig.A la figura 3A, l'orbital molecular més alt ocupat (HOMO) de RuDA monomèric es deslocalitza al llarg de la columna vertebral del lligand i l'orbital molecular més baix desocupat (LUMO) es centra a la unitat acceptora de TDP.Per contra, la densitat d'electrons del dímer HOMO es concentra en el lligand d'una molècula de RuDA, mentre que la densitat d'electrons del LUMO es concentra principalment en la unitat acceptora d'una altra molècula de RuDA, la qual cosa indica que RuDA es troba al dímer.Característiques de la TC.
A L'HOMO i el LUMO del mineral es calculen en formes monomèriques i dimèriques.B Nivells d'energia singlet i triplet del mineral en monòmers i dímers.C Nivells estimats de RuDA i possibles canals ISC com a C monomèric i D dimèric. Les fletxes indiquen possibles canals ISC.
La distribució d'electrons i forats en els estats excitats del singlet de baixa energia de RuDA en les formes monomèriques i dimèriques es va analitzar mitjançant el programari Multiwfn 3.852.53, que es va calcular mitjançant el mètode TD-DFT.Tal com s'indica a l'etiqueta addicional.Com es mostra a les figures 1-2, els forats RDA monomèrics es deslocalitzen majoritàriament al llarg de la columna vertebral del lligand en aquests estats excitats de singlet, mentre que els electrons es troben majoritàriament al grup TDP, demostrant les característiques intramoleculars de la TC.A més, per a aquests estats excitats singlet, hi ha més o menys solapament entre forats i electrons, cosa que suggereix que aquests estats excitats singlet contribueixen a l'excitació local (LE).Per als dímers, a més de les característiques de TC i LE intramoleculars, es va observar una certa proporció de característiques de TC intermoleculars en els estats respectius, especialment S3, S4, S7 i S8, basades en l'anàlisi de TC intermolecular, amb les transicions intermoleculars de CT com a principals. (Taula complementària).3).
Per entendre millor els resultats experimentals, vam explorar encara més les propietats dels estats excitats de RuDA per explorar les diferències entre monòmers i dímers (taules suplementàries 4-5).Com es mostra a la figura 3B, els nivells d'energia dels estats excitats singlet i triplet del dímer són molt més densos que els del monòmer, cosa que ajuda a reduir la bretxa d'energia entre S1 i Tn. S'ha informat que les transicions ISC es podrien realitzar dins d'un petit buit energètic (ΔES1-Tn <0, 3 eV) entre S1 i Tn54. S'ha informat que les transicions ISC es podrien realitzar dins d'un petit buit energètic (ΔES1-Tn <0, 3 eV) entre S1 i Tn54. Сообщалось, что переходы ISC могут быть реализованы в пределах небольшой энергоды энергето энергето энергеть энергетич 1.01 S'ha informat que les transicions ISC es poden realitzar dins d'un petit buit energètic (ΔES1-Tn <0, 3 eV) entre S1 i Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。 Сообщалось, что переход ISC может быть реализован в пределах небольшой энергельшой энергетич Δ40Сим Сообщалось S'ha informat que la transició ISC es pot realitzar dins d'un petit buit energètic (ΔES1-Tn <0, 3 eV) entre S1 i Tn54.A més, només un orbital, ocupat o desocupat, ha de diferir en estats singlet i triplet lligats per proporcionar una integral SOC diferent de zero.Així, a partir de l'anàlisi de l'energia d'excitació i la transició orbital, es mostren tots els canals possibles de la transició ISC a les Figs.3C,D.En particular, només un canal ISC està disponible al monòmer, mentre que la forma dimèrica té quatre canals ISC que poden millorar la transició ISC.Per tant, és raonable suposar que com més molècules de RuDA s'agreguin, més accessibles seran els canals ISC.Per tant, els agregats RuDA poden formar estructures electròniques de dues bandes en els estats singlet i triplet, reduint la bretxa d'energia entre S1 i Tn disponible, augmentant així l'eficiència de l'ISC per facilitar la generació d'1O2.
Per dilucidar encara més el mecanisme subjacent, vam sintetitzar un compost de referència del complex arè-Ru (II) (RuET) substituint dos grups etil per dos grups fenil de trifenilamina a RuDA (Fig. 4A, per a una caracterització completa, vegeu ESI, suplementari 15). -21 ) De donant (dietilamina) a acceptor (TDF), RuET té les mateixes característiques de TC intramolecular que RuDA.Com era d'esperar, l'espectre d'absorció de RuET en DMF va mostrar una banda de transferència de càrrega de baixa energia amb una forta absorció a la regió de l'infraroig proper a la regió de 600-1100 nm (Fig. 4B).A més, també es va observar l'agregació de RuET amb un contingut d'aigua creixent, que es va reflectir en el desplaçament cap al vermell del màxim d'absorció, que es va confirmar encara més mitjançant imatges AFM líquides (figura suplementària 22).Els resultats mostren que RuET, com RuDA, pot formar estats intramoleculars i autoassemblar-se en estructures agregades.
Estructura química de RuET.B Espectres d'absorció de RuET en mescles de diverses proporcions de DMF i aigua.Parcel·les C EIS Nyquist per a RuDA i RuET.Respostes fotocorrents D de RuDA i RuET sota l'acció de la radiació làser amb una longitud d'ona de 808 nm.
La fotodegradació d'ABDA en presència de RuET es va avaluar per irradiació amb un làser amb una longitud d'ona de 808 nm.Sorprenentment, no es va observar cap degradació d'ABDA en diverses fraccions d'aigua (figura suplementària 23).Una possible raó és que RuET no pot formar de manera eficient una estructura electrònica en bandes perquè la cadena etílica no promou una transferència de càrrega intermolecular eficient.Per tant, es van realitzar espectroscòpia d'impedància electroquímica (EIS) i mesures de fotocorrent transitori per comparar les propietats fotoelectroquímiques de RuDA i RuET.Segons el diagrama de Nyquist (figura 4C), RuDA mostra un radi molt més petit que RuET, el que significa que RuDA56 té un transport d'electrons intermoleculars més ràpid i una millor conductivitat.A més, la densitat de fotocorrent de RuDA és molt superior a la de RuET (Fig. 4D), cosa que confirma la millor eficiència de transferència de càrrega de RuDA57.Així, el grup fenil de la trifenilamina del mineral té un paper important en la transferència de càrrega intermolecular i la formació d'una estructura electrònica en bandes.
Per augmentar l'acumulació de tumors i la biocompatibilitat in vivo, vam encapsular encara més RuDA amb F127.Es va determinar que el diàmetre hidrodinàmic mitjà de RuDA-NPs era de 123, 1 nm amb una distribució estreta (PDI = 0, 089) mitjançant el mètode de dispersió de la llum dinàmica (DLS) (figura 5A), que va promoure l'acumulació de tumors augmentant la permeabilitat i la retenció.efecte EPR).Les imatges TEM van mostrar que els Ore NP tenen una forma esfèrica uniforme amb un diàmetre mitjà de 86 nm.En particular, el màxim d'absorció de RuDA-NP va aparèixer a 800 nm (figura suplementària 24), cosa que indica que els RuDA-NP poden conservar les funcions i propietats dels RuDA autoassemblants.El rendiment quàntic de ROS calculat per a NP Ore és del 15,9%, que és comparable a Ore. Les propietats fototèrmiques dels RuDA NPs es van estudiar sota l'acció de la radiació làser amb una longitud d'ona de 808 nm mitjançant una càmera infraroja.Com es mostra a la fig.5B, C, el grup control (només PBS) va experimentar un lleuger augment de la temperatura, mentre que la temperatura de la solució RuDA-NPs va augmentar ràpidament amb l'augment de la temperatura (ΔT) fins a 15, 5, 26, 1 i 43, 0 ° C.Les concentracions elevades van ser de 25, 50 i 100 µM, respectivament, la qual cosa indica un fort efecte fototèrmic dels RuDA NPs.A més, es van prendre mesures del cicle de calefacció/refrigeració per avaluar l'estabilitat fototèrmica de RuDA-NP i comparar-la amb ICG.La temperatura dels minerals NP no va disminuir després de cinc cicles d'escalfament / refredament (Fig. 5D), cosa que indica l'excel·lent estabilitat fototèrmica dels minerals NP.En canvi, l'ICG presenta una estabilitat fototèrmica més baixa tal com es veu des de l'aparent desaparició de l'altiplà de temperatura fototèrmica en les mateixes condicions.Segons el mètode anterior58, l'eficiència de conversió fototèrmica (PCE) de RuDA-NP es va calcular en un 24,2%, que és superior als materials fototèrmics existents, com ara nanorodes d'or (21,0%) i nanoshells d'or (13,0%)59.Així, NP Ore presenta excel·lents propietats fototèrmiques, cosa que els converteix en agents PTT prometedors.
Anàlisi d'imatges DLS i TEM de RuDA NPs (insert).B Imatges tèrmiques de diverses concentracions de RuDA NPs exposades a radiació làser a una longitud d'ona de 808 nm (0,5 W cm-2).C Corbes de conversió fototèrmica de diverses concentracions de minerals NP, que són dades quantitatives.B. D Increment de la temperatura d'ORE NP i ICG en 5 cicles de calefacció-refrigeració.
Es va avaluar in vitro la fotocitotoxicitat de RuDA NPs contra cèl·lules de càncer de mama humanes MDA-MB-231.Com es mostra a la fig.6A, B, RuDA-NPs i RuDA presentaven una citotoxicitat insignificant en absència d'irradiació, la qual cosa implicava una menor toxicitat fosca de RuDA-NPs i RuDA.Tanmateix, després de l'exposició a la radiació làser a una longitud d'ona de 808 nm, els NP RuDA i RuDA van mostrar una forta fotocitotoxicitat contra les cèl·lules canceroses MDA-MB-231 amb valors IC50 (concentració inhibidora a la meitat màxima) de 5,4 i 9,4 μM, respectivament, demostrant que RuDA-NP i RuDA tenen potencial per a la fototeràpia del càncer.A més, es va investigar més la fotocitotoxicitat de RuDA-NP i RuDA en presència de vitamina C (Vc), un eliminador de ROS, per dilucidar el paper de les ROS en la citotoxicitat induïda per la llum.Òbviament, la viabilitat cel·lular va augmentar després de l'addició de Vc, i els valors IC50 de RuDA i RuDA NPs van ser de 25, 7 i 40, 0 μM, respectivament, la qual cosa demostra el paper important de ROS en la fotocitotoxicitat de RuDA i RuDA NPs.Citotoxicitat induïda per la llum de RuDA-NPs i RuDA en cèl·lules canceroses MDA-MB-231 mitjançant tinció de cèl·lules vives / mortes mitjançant calceïna AM (fluorescència verda per a cèl·lules vives) i iodur de propidi (PI, fluorescència vermella per a cèl·lules mortes).confirmat per les cèl·lules) com a sondes fluorescents.Com es mostra a la figura 6C, les cèl·lules tractades amb RuDA-NP o RuDA es van mantenir viables sense irradiació, com ho demostra la fluorescència verda intensa.Per contra, sota irradiació làser, només es va observar fluorescència vermella, la qual cosa confirma la fotocitotoxicitat efectiva dels NP RuDA o RuDA.Cal destacar que la fluorescència verda va aparèixer després de l'addició de Vc, la qual cosa indica una violació de la fotocitotoxicitat de RuDA i RuDA NPs.Aquests resultats són coherents amb els assaigs de fotocitotoxicitat in vitro.
Viabilitat depenent de la dosi de les cèl·lules A RuDA- i B RuDA-NP a les cèl·lules MDA-MB-231 en presència o absència de Vc (0, 5 mM), respectivament.Barres d'error, mitjana ± desviació estàndard (n = 3). Proves t no aparellades i de dues cares *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Proves t no aparellades i de dues cares *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Proves t de dues cues no aparellades *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Proves t de dues cues no aparellades *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.C Anàlisi de tinció de cèl·lules vives/morts utilitzant calceïna AM i iodur de propidi com a sondes fluorescents.Barra d'escala: 30 µm.Es mostren imatges representatives de tres repeticions biològiques de cada grup.D Imatges de fluorescència confocal de la producció de ROS a cèl·lules MDA-MB-231 en diferents condicions de tractament.La fluorescència de DCF verda indica la presència de ROS.Irradieu amb un làser amb una longitud d'ona de 808 nm amb una potència de 0,5 W/cm2 durant 10 minuts (300 J/cm2).Barra d'escala: 30 µm.Es mostren imatges representatives de tres repeticions biològiques de cada grup.E Anàlisi del tractament amb citometria de flux RuDA-NPs (50 µM) o RuDA (50 µM) amb o sense làser de 808 nm (0,5 W cm-2) en presència i absència de Vc (0,5 mM) durant 10 min.Es mostren imatges representatives de tres repeticions biològiques de cada grup.F Nrf-2, HSP70 i HO-1 de cèl·lules MDA-MB-231 tractades amb RuDA-NPs (50 µM) amb o sense irradiació làser de 808 nm (0,5 W cm-2, 10 min, 300 J cm-2), les cèl·lules expressen 2).Es mostren imatges representatives de dues repeticions biològiques de cada grup.
La producció intracel·lular de ROS a les cèl·lules MDA-MB-231 es va examinar mitjançant el mètode de tinció de diacetat de 2,7-diclorodihidrofluoresceïna (DCFH-DA).Com es mostra a la fig.A la figura 6D, les cèl·lules tractades amb RuDA-NPs o RuDA van mostrar una fluorescència verda diferent quan es van irradiar amb el làser de 808 nm, cosa que indica que RuDA-NP i RuDA tenen una capacitat eficient per generar ROS.Per contra, en absència de llum o en presència de Vc, només es va observar un senyal fluorescent feble de les cèl·lules, que indicava una lleu formació de ROS.Els nivells de ROS intracel·lulars a les cèl·lules RuDA-NP i a les cèl·lules MDA-MB-231 tractades amb RuDA es van determinar encara més mitjançant citometria de flux.Tal com es mostra a la figura suplementària 25, la intensitat de fluorescència mitjana (MFI) generada per RuDA-NP i RuDA sota la irradiació làser de 808 nm es va augmentar significativament unes 5, 1 i 4, 8 vegades, respectivament, en comparació amb el grup control, confirmant la seva excel·lent formació AFK.capacitat.Tanmateix, els nivells intracel·lulars de ROS a les cèl·lules RuDA-NP o MDA-MB-231 tractades amb RuDA només eren comparables als controls sense irradiació làser o en presència de Vc, similar als resultats de l'anàlisi de fluorescència confocal.
S'ha demostrat que els mitocondris són l'objectiu principal dels complexos Ru(II)-areno60.Per tant, es va investigar la localització subcel·lular de RuDA i RuDA-NPs.Com es mostra a la figura suplementària 26, RuDA i RuDA-NP mostren perfils de distribució cel·lular similars amb l'acumulació més alta als mitocondris (62, 5 ± 4, 3 i 60, 4 ± 3, 6 ng/mg de proteïna, respectivament).Tanmateix, només es va trobar una petita quantitat de Ru a les fraccions nuclears de Ore i NP Ore (3,5 i 2,1%, respectivament).La fracció cel·lular restant contenia ruteni residual: 31,7% (30,6 ± 3,4 ng/mg de proteïna) per a RuDA i 42,9% (47,2 ± 4,5 ng/mg de proteïna) per a RuDA-NPs.En general, el mineral i el mineral NP s'acumulen principalment als mitocondris.Per avaluar la disfunció mitocondrial, hem utilitzat la tinció JC-1 i MitoSOX Red per avaluar el potencial de la membrana mitocondrial i la capacitat de producció de superòxid, respectivament.Tal com es mostra a la figura suplementària 27, es va observar una fluorescència verda intensa (JC-1) i vermella (MitoSOX Red) a les cèl·lules tractades amb RuDA i RuDA-NP sota irradiació làser de 808 nm, cosa que indica que tant RuDA com RuDA-NP són molt fluorescents. Pot induir eficaçment la despolarització de la membrana mitocondrial i la producció de superòxid.A més, es va determinar el mecanisme de mort cel·lular mitjançant l'anàlisi basada en citometria de flux de l'annexina V-FITC/iodur de propidi (PI).Com es mostra a la figura 6E, quan es van irradiar amb làser de 808 nm, RuDA i RuDA-NP van induir una taxa d'apoptosi primerenca augmentada significativament (quadrant inferior dret) a les cèl·lules MDA-MB-231 en comparació amb PBS o PBS més làser.cèl·lules processades.Tanmateix, quan es va afegir Vc, la taxa d'apoptosi de RuDA i RuDA-NP va disminuir significativament del 50, 9% i 52, 0% al 15, 8% i 17, 8%, respectivament, la qual cosa confirma el paper important de ROS en la fotocitotoxicitat de RuDA i RuDA-NP..A més, es van observar lleugeres cèl·lules necròtiques en tots els grups provats (quadrant superior esquerre), cosa que suggereix que l'apoptosi pot ser la forma predominant de mort cel·lular induïda per RuDA i RuDA-NP.
Com que el dany per l'estrès oxidatiu és un determinant important de l'apoptosi, es va investigar el factor nuclear associat a l'eritroide 2, factor 2 (Nrf2) 62, un regulador clau del sistema antioxidant, en MDA-MB-231 tractat amb RuDA-NPs.Mecanisme d'acció de RuDA NPs induït per irradiació.Al mateix temps, també es va detectar l'expressió de la proteïna hemo oxigenasa 1 (HO-1) aigües avall.Com es mostra a la figura 6F i a la figura suplementària 29, la fototeràpia mediada per RuDA-NP va augmentar els nivells d'expressió de Nrf2 i HO-1 en comparació amb el grup PBS, cosa que indica que RuDA-NPs poden estimular les vies de senyalització de l'estrès oxidatiu.A més, per estudiar l'efecte fototèrmic de RuDA-NPs63, també es va avaluar l'expressió de la proteïna de xoc tèrmic Hsp70.És clar que les cèl·lules tractades amb RuDA-NPs + irradiació làser de 808 nm van mostrar una expressió més gran de Hsp70 en comparació amb els altres dos grups, reflectint una resposta cel·lular a la hipertèrmia.
Els notables resultats in vitro ens van impulsar a investigar el rendiment in vivo de RuDA-NP en ratolins nus amb tumors MDA-MB-231.La distribució dels teixits de RuDA NPs es va estudiar determinant el contingut de ruteni al fetge, cor, melsa, ronyons, pulmons i tumors.Com es mostra a la fig.A la figura 7A, el contingut màxim de NP de mineral en òrgans normals va aparèixer en el primer temps d'observació (4 h), mentre que el contingut màxim es va determinar en teixits tumorals 8 hores després de la injecció, possiblement a causa dels NP de mineral.Efecte EPR de LF.Segons els resultats de la distribució, la durada òptima del tractament amb mineral NP es va prendre 8 hores després de l'administració.Per il·lustrar el procés d'acumulació de RuDA-NP en llocs tumorals, es van controlar les propietats fotoacústiques (PA) dels RuDA-NP registrant els senyals PA de RuDA-NP en diferents moments després de la injecció.En primer lloc, es va avaluar el senyal PA de RuDA-NP in vivo enregistrant imatges PA d'un lloc tumoral després de la injecció intratumoral de RuDA-NP.Tal com es mostra a la figura suplementària 30, els RuDA-NP van mostrar un fort senyal de PA i hi va haver una correlació positiva entre la concentració de RuDA-NP i la intensitat del senyal de PA (figura suplementària 30A).A continuació, es van registrar imatges de PA in vivo de llocs tumorals després de la injecció intravenosa de RuDA i RuDA-NP en diferents moments després de la injecció.Tal com es mostra a la figura 7B, el senyal PA de RuDA-NPs del lloc del tumor va augmentar gradualment amb el temps i va arribar a un altiplà a les 8 hores després de la injecció, d'acord amb els resultats de distribució de teixits determinats per l'anàlisi ICP-MS.Pel que fa a RuDA (figura suplementària 30B), la intensitat màxima del senyal PA va aparèixer 4 hores després de la injecció, cosa que indica una velocitat ràpida d'entrada de RuDA al tumor.A més, es va investigar el comportament excretor de RuDA i RuDA-NP determinant la quantitat de ruteni a l'orina i les femtes mitjançant ICP-MS.La via principal d'eliminació de RuDA (figura suplementària 31) i RuDA-NP (Fig. 7C) és a través de les femtes, i es va observar una eliminació efectiva de RuDA i RuDA-NP durant el període d'estudi de 8 dies, cosa que significa que RuDA i els RuDA-NP es poden eliminar de manera eficient del cos sense toxicitat a llarg termini.
A. La distribució ex vivo de RuDA-NP en teixits de ratolí es va determinar pel contingut de Ru (percentatge de dosi administrada de Ru (ID) per gram de teixit) en diferents moments després de la injecció.Les dades són mitjanes ± desviació estàndard (n = 3). Proves t no aparellades i de dues cares *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Proves t no aparellades i de dues cares *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Proves t de dues cues no aparellades *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Proves t de dues cues no aparellades *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.Imatges B PA de llocs tumorals in vivo a 808 nm d'excitació després de l'administració intravenosa de RuDA-NPs (10 µmol kg-1) en diferents moments.Després de l'administració intravenosa de RuDA NPs (10 µmol kg-1), C Ru es va excretar dels ratolins amb orina i femta a diferents intervals de temps.Les dades són mitjanes ± desviació estàndard (n = 3).
La capacitat de calefacció de RuDA-NP in vivo es va estudiar en ratolins nus amb tumors MDA-MB-231 i RuDA per a la seva comparació.Com es mostra a la fig.8A i la figura suplementària 32, el grup control (solució salina) va mostrar menys canvi de temperatura (ΔT ≈ 3 °C) després de 10 minuts d'exposició contínua.Tanmateix, la temperatura de RuDA-NP i RuDA va augmentar ràpidament amb temperatures màximes de 55, 2 i 49, 9 ° C, respectivament, proporcionant una hipertèrmia suficient per a la teràpia del càncer in vivo.L'augment observat de l'alta temperatura dels NP RuDA (ΔT ≈ 24 °C) en comparació amb RuDA (ΔT ≈ 19 °C) pot ser degut a la seva millor permeabilitat i acumulació en els teixits tumorals a causa de l'efecte EPR.
Imatges tèrmiques d'infrarojos de ratolins amb tumors MDA-MB-231 irradiats amb làser de 808 nm en diferents moments 8 hores després de la injecció.Es mostren imatges representatives de quatre repeticions biològiques de cada grup.B Volum relatiu del tumor i C Massa tumoral mitjana de diferents grups de ratolins durant el tractament.D Corbes de pes corporals de diferents grups de ratolins.Irradieu amb un làser amb una longitud d'ona de 808 nm amb una potència de 0,5 W/cm2 durant 10 minuts (300 J/cm2).Barres d'error, mitjana ± desviació estàndard (n = 3). Proves t no aparellades i de dues cares *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Proves t no aparellades i de dues cares *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Proves t de dues cues no aparellades *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Proves t de dues cues no aparellades *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001. Imatges de tinció d'E H&E d'òrgans i tumors principals de diferents grups de tractament, inclosos els grups Saline, Saline + Laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs i RuDA-NPs + Laser. Imatges de tinció d'E H&E d'òrgans i tumors principals de diferents grups de tractament, inclosos els grups Saline, Saline + Laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs i RuDA-NPs + Laser. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. Imatges de tinció d'H&E d'òrgans i tumors principals de diferents grups de tractament, inclosos els grups de solució salina, solució salina + làser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs i RuDA-NPs + Laser.来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E 染色图像，包括盐水、盐水+ 来自不图像，包括盐水、盐水+ 来自不图像，包括盐水、盐水+ 态盐水+ 态Ru-DA〉怿-DA〉怿-DA〉 Ru-DA〉恀DA来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Окрашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. Tinció E H&E d'òrgans i tumors principals de diversos grups de tractament, com ara solució salina, solució salina + làser, RuDA, RuDA + làser, RuDA-NPs i RuDA-NPs + làser.Barra d'escala: 60 µm.
Es va avaluar l'efecte de la fototeràpia in vivo amb RuDA i RuDA NPs en què ratolins nus amb tumors MDA-MB-231 van ser injectats per via intravenosa amb RuDA o RuDA NPs en una sola dosi de 10, 0 µmol kg-1 a través de la vena de la cua, i després 8 hores després de la injecció.irradiació làser amb una longitud d'ona de 808 nm.Com es mostra a la figura 8B, els volums del tumor van augmentar significativament en els grups de solució salina i làser, cosa que indica que la irradiació de solució salina o làser 808 va tenir poc efecte sobre el creixement del tumor.Igual que en el grup salí, també es va observar un creixement ràpid del tumor en ratolins tractats amb RuDA-NPs o RuDA en absència d'irradiació làser, demostrant la seva baixa toxicitat fosca.En canvi, després de la irradiació làser, tant el tractament amb RuDA-NP com amb RuDA van induir una regressió tumoral significativa amb reduccions del volum del tumor del 95, 2% i del 84, 3%, respectivament, en comparació amb el grup tractat amb solució salina, cosa que indica una PDT sinèrgica excel·lent., mediat per l'efecte RuDA/CHTV.– NP o Ore. En comparació amb RuDA, els RuDA NP van mostrar un millor efecte fototerapèutic, que es va deure principalment a l'efecte EPR dels RuDA NP.Els resultats de la inhibició del creixement del tumor es van avaluar més mitjançant el pes del tumor extirpat el dia 15 del tractament (Fig. 8C i Fig. 33 suplementària).La massa tumoral mitjana en ratolins tractats amb RuDA-NP i ratolins tractats amb RuDA va ser de 0, 08 i 0, 27 g, respectivament, que era molt més lleugera que en el grup control (1, 43 g).
A més, es va registrar el pes corporal dels ratolins cada tres dies per estudiar la toxicitat fosca de RuDA-NPs o RuDA in vivo.Com es mostra a la figura 8D, no es van observar diferències significatives en el pes corporal per a tots els grups de tractament. A més, es va realitzar la tinció d'hematoxilina i eosina (H&E) dels òrgans principals (cor, fetge, melsa, pulmó i ronyó) de diferents grups de tractament. A més, es va realitzar la tinció d'hematoxilina i eosina (H&E) dels òrgans principals (cor, fetge, melsa, pulmó i ronyó) de diferents grups de tractament. Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) из разных групп лечения. A més, es va realitzar una tinció d'hematoxilina i eosina (H&E) dels òrgans principals (cor, fetge, melsa, pulmons i ronyons) de diferents grups de tractament.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进肾脏）进行苲官咜柉进行苲官 (H&E) Кроме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) в различных группах лечения. A més, es va realitzar una tinció d'hematoxilina i eosina (H&E) dels òrgans principals (cor, fetge, melsa, pulmó i ronyó) en diferents grups de tractament.Com es mostra a la Fig.A la figura 8E, les imatges de tinció H&E de cinc òrgans principals dels grups RuDA-NP i RuDA no presenten anomalies òbvies ni danys en els òrgans. A la figura 8E, les imatges de tinció H&E de cinc òrgans principals dels grups RuDA-NP i RuDA no presenten anomalies òbvies ni danys en els òrgans.Com es mostra a la fig.8E, изображения окрашивания H&E пяти основных органов из групп RuDA-NPs и RuDA не демонстрируюти основных органос 8E, les imatges de tinció d'H&E de cinc òrgans principals dels grups RuDA-NPs i RuDA no mostren anomalies ni lesions d'òrgans evidents.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显示傘显示出显示出显五个主要器官的H&E如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Ка показано на рисунке 8e, изобения окрашивания h & e пяти основных аения з з з з г г г г пя ня наз ааз ааз аз ая ая ая ая а а а а а ая а ая ая аver ня а. Com es mostra a la figura 8E, les imatges de tinció d'H&E dels cinc òrgans principals dels grups RuDA-NP i RuDA no van mostrar anomalies evidents ni danys en els òrgans.Aquests resultats van mostrar que ni RuDA-NP ni RuDA mostraven signes de toxicitat in vivo. A més, les imatges de tinció de tumors amb H&E van demostrar que tant els grups RuDA + Laser com RuDA-NPs + Laser podrien causar una destrucció severa de cèl·lules canceroses, demostrant l'excel·lent eficàcia fototerapèutica in vivo de RuDA i RuDA-NPs. A més, les imatges de tinció de tumors amb H&E van demostrar que tant els grups RuDA + Laser com RuDA-NPs + Laser podrien causar una destrucció severa de cèl·lules canceroses, demostrant l'excel·lent eficàcia fototerapèutica in vivo de RuDA i RuDA-NPs.A més, les imatges de tumors tenyits d'hematoxilina-eosina van mostrar que tant els grups RuDA + Laser com RuDA-NPs + Laser poden induir una destrucció severa de cèl·lules canceroses, demostrant l'eficàcia fototerapèutica superior de RuDA i RuDA-NPs in vivo.此外 ， 肿瘤 的 H & e 染色 图像 显示 ， ruda + làser 和 ruda-nps + làser 组均 可 导致 严重 的 癌细胞 破坏 ， 证明 了 ruda 和 ruda-nps 的 优异 的 体内 光疗 光疗 功效。。此外 ， 肿瘤 的 & e 染色 显示 ， ruda + làser 和 ruda-nps + làser 组均 导致 的 癌 细胞 破坏 ， 证明 ruda 和 ruda-nps 的 的 体内 光疗 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。A més, les imatges de tumors tenyides d'hematoxilina i eosina van mostrar que tant els grups RuDA + Laser com RuDA-NPs + Laser van donar lloc a una destrucció severa de cèl·lules canceroses, demostrant una eficàcia fototerapèutica superior de RuDA i RuDA-NPs in vivo.
En conclusió, el complex organometàl·lic Ru (II)-arene (RuDA) amb lligands de tipus DA es va dissenyar per facilitar el procés ISC mitjançant el mètode d'agregació.RuDA sintetitzat es pot autoassemblar mitjançant interaccions no covalents per formar sistemes supramoleculars derivats de RuDA, facilitant així la formació d'1O2 i una conversió fototèrmica eficient per a la teràpia del càncer induïda per la llum.Cal destacar que RuDA monomèric no va generar 1O2 sota irradiació làser a 808 nm, però podria generar una gran quantitat d'1O2 en estat agregat, demostrant la racionalitat i l'eficiència del nostre disseny.Estudis posteriors han demostrat que el conjunt supramolecular dota a RuDA de propietats fotofísiques i fotoquímiques millorades, com ara l'absorció de desplaçament cap al vermell i la resistència al fotoblanqueig, que són molt desitjables per al processament de PDT i PTT.Tant els experiments in vitro com in vivo han demostrat que els NP RuDA amb bona biocompatibilitat i bona acumulació al tumor presenten una excel·lent activitat anticancerígen induïda per la llum després de la irradiació làser a una longitud d'ona de 808 nm.Així, els RuDA NPs com a reactius PDT/PTW supramoleculars bimodals eficaços enriquiran el conjunt de fotosensibilitzadors activats a longituds d'ona superiors a 800 nm.El disseny conceptual del sistema supramolecular proporciona una ruta eficient per als fotosensibilitzadors activats per NIR amb excel·lents efectes fotosensibilitzants.
Tots els productes químics i dissolvents es van obtenir de proveïdors comercials i es van utilitzar sense més purificació.RuCl3 es va comprar a Boren Precious Metals Co., Ltd. (Kunming, Xina).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolina-5,6-diona) i 4,7-bis[4-(N,N-difenilamino)fenil]-5 El ,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol es va sintetitzar segons estudis anteriors64,65.Els espectres de RMN es van registrar en un espectròmetre Bruker Avance III-HD de 600 MHz al Centre de proves analítiques de la Universitat del Sud-est utilitzant d6-DMSO o CDCl3 com a dissolvent.Els desplaçaments químics δ es donen en ppm.respecte al tetrametilsilà, i les constants d'interacció J es donen en valors absoluts en hertz.Es va realitzar espectrometria de masses d'alta resolució (HRMS) en un instrument Agilent 6224 ESI/TOF MS.L'anàlisi elemental de C, H i N es va realitzar en un analitzador elemental Vario MICROCHNOS (Elementar).Els espectres UV-visibles es van mesurar amb un espectrofotòmetre Shimadzu UV3600.Els espectres de fluorescència es van registrar en un espectrofluorímetre Shimadzu RF-6000.Els espectres EPR es van registrar en un instrument Bruker EMXmicro-6/1.La morfologia i l'estructura de les mostres preparades es van estudiar amb instruments FEI Tecnai G20 (TEM) i Bruker Icon (AFM) que funcionen a una tensió de 200 kV.La dispersió de la llum dinàmica (DLS) es va realitzar en un analitzador Nanobrook Omni (Brookhaven).Les propietats fotoelectroquímiques es van mesurar en una configuració electroquímica (CHI-660, Xina).Les imatges fotoacústiques es van obtenir mitjançant el sistema FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR.Les imatges confocals es van obtenir mitjançant un microscopi confocal Olympus FV3000.L'anàlisi FACS es va realitzar en un citòmetre de flux BD Calibur.Es van realitzar experiments de cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) en un sistema Waters Alliance e2695 mitjançant un detector 2489 UV/Vis.Les proves de cromatografia de permeació de gel (GPC) es van registrar en un instrument Thermo ULTIMATE 3000 mitjançant un detector d'índex de refracció ERC RefratoMax520.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolina-5,6-diona)64 (481,0 mg, 1,0 mmol), 4,7-bis[4 -(N, N-difenilamino)fenil]-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol 65 (652,0 mg, 1,0 mmol) i àcid acètic glacial (30 ml) es van agitar a la nevera de reflux durant 12 hores.A continuació, es va eliminar el dissolvent al buit mitjançant un evaporador rotatiu.El residu resultant es va purificar mitjançant cromatografia en columna flash (gel de sílice, CH2Cl2:MeOH = 20:1) per obtenir RuDA com a pols verda (rendiment: 877,5 mg, 80%).anus.Calculat per a C64H48Cl2N8RuS: C 67,84, H 4,27, N 9,89.Trobat: C 67,92, H 4,26, N 9,82.1H RMN (600 MHz, d6-DMSO) δ 10,04 (s, 2H), 8,98 (s, 2H), 8,15 (s, 2H), 7,79 (s, 4H), 7,44 (s, 8H), 7,21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, 1H), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13C RMN (150 MHz, D6-DMSO), Δ (PPM) 158.03, 152.81, 149,31, 147,98, 147,16, 139,98, 136.21, 135,57, 134,68, 130,34, 130.02, 128,68, 128,01, 125.51, 124.45, 103.89, 103.89, 103.89, 103.89, 103.89, 103.49, 103.49, 103.49, 103.49, 124.45, 124.45, 124.45, 124.45, 103.45, 120. , 103. , 86,52, 84,75, 63,29, 30,90, 22,29, 18,83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097,25.
Síntesi de 4,7-bis[4-(N,N-dietilamino)fenil-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol (L2): L2 es va sintetitzar en dos passos.Es va afegir Pd(PPh3)4 (46 mg, 0,040 mmol) a la solució de N,N-dietil-4-(tributilstannil)anilina (1,05 g, 2,4 mmol) i 4,7-dibromo-5,6-dinitro - 2, 1,3-benzotiadiazol (0,38 g, 1,0 mmol) en toluè sec (100 ml).La mescla es va agitar a 100 °C durant 24 hores.Després d'eliminar el toluè al buit, el sòlid resultant es va rentar amb èter de petroli.A continuació, es va agitar una barreja d'aquest compost (234,0 mg, 0,45 mmol) i pols de ferro (0,30 g, 5,4 mmol) en àcid acètic (20 ml) a 80ºC durant 4 hores.La mescla de reacció es va abocar en aigua i el sòlid marró resultant es va recollir per filtració.El producte es va purificar dues vegades per sublimació al buit per donar un sòlid verd (126,2 mg, rendiment del 57%).anus.Calculat per a C26H32N6S: C 67,79, H 7,00, N 18,24.Trobat: C 67,84, H 6,95, H 18,16.1H RMN (600 MHz, CDCl3), δ (ppm) 7,42 (d, 4H), 6,84 (d, 4H), 4,09 (s, 4H), 3,42 (d, 8H), 1,22 (s, 12H).13С RMN (150 MHz, CDCl3), δ (ppm) 151,77, 147,39, 138,07, 131,20, 121,09, 113,84, 111,90, 44,34, 12,77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461,24.
Els compostos es van preparar i purificar seguint procediments similars al RuDA.anus.Calculat per a C48H48Cl2N8RuS: C 61,27, H 5,14, N 11,91.Trobat: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81, 1H RMN (600 MHz, d6-DMSO), δ (ppm) 10,19 (s, 2H), 9,28 (s, 2H), 8,09 (s, 2H), 7,95 (s, 4H), 6,93 (s, 4H), 6,48 (d, 2H), 6,34 (s, 2H), 3,54 (t, 8H), 2,80 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 1,31 (t, 12H), 1,07 (s, 6H).13C RMN (151 MHz, CDCL3), Δ (PPM) 158.20, 153,36, 148,82, 148,14, 138,59, 136,79, 135,75, 134,71, 130,44, 128,87, 128,35, 121,70, 111,84, 110,76, 105.07, 105.07, 105.07, 87.0, 84.23., 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905,24.
RuDA es va dissoldre en MeOH/H2O (5/95, v/v) a una concentració de 10 μM.L'espectre d'absorció de RuDA es va mesurar cada 5 minuts en un espectrofotòmetre Shimadzu UV-3600 sota irradiació amb llum làser amb una longitud d'ona de 808 nm (0,5 W/cm2).Els espectres ICG es van registrar en les mateixes condicions que l'estàndard.
Els espectres EPR es van registrar en un espectròmetre Bruker EMXmicro-6/1 amb una potència de microones de 20 mW, un rang d'exploració de 100 G i una modulació de camp d'1 G. 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidona (TEMP) i N-òxid de 5,5-dimetil-1-pirrolina (DMPO) es van utilitzar com a trampes de rotació.Es van registrar espectres de ressonància d'espin electrònic per a solucions mixtes de RuDA (50 µM) i TEMF (20 mM) o DMPO (20 mM) sota l'acció de radiació làser amb una longitud d'ona de 808 nm (0,5 W/cm2).
Els càlculs DFT i TD-DFT per a RuDA es van realitzar a nivells de PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ en solució aquosa mitjançant el programa gaussià 1666,67,68.Les distribucions HOMO-LUMO, forats i electrons de l'estat excitat del singlet de baixa energia RuDA es van representar mitjançant el programa GaussView (versió 5.0).
Primer vam intentar mesurar l'eficiència de generació d'1O2 RuDA mitjançant espectroscòpia UV-visible convencional amb ICG (ΦΔ = 0, 002) com a estàndard, però la fotodegradació de l'ICG va afectar fortament els resultats.Així, el rendiment quàntic d'1O2 RuDA es va mesurar detectant un canvi en la intensitat de la fluorescència ABDA a uns 428 nm quan es va irradiar amb un làser amb una longitud d'ona de 808 nm (0,5 W/cm2).Es van realitzar experiments amb RuDA i RuDA NP (20 μM) en aigua/DMF (98/2, v/v) que contenia ABDA (50 μM).El rendiment quàntic d'1O2 es va calcular mitjançant la fórmula següent: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS i rICG són les velocitats de reacció d'ABDA amb 1O2 obtinguts del fotosensibilitzador i ICG, respectivament.APS i AICG són l'absorbància del fotosensibilitzador i ICG a 808 nm, respectivament.
Les mesures AFM es van realitzar en condicions líquides mitjançant el mode d'escaneig en un sistema AFM Bruker Dimension Icon.Utilitzant una estructura oberta amb cèl·lules líquides, les cèl·lules es van rentar dues vegades amb etanol i es van assecar amb un corrent de nitrogen.Inseriu les cèl·lules seques al capçal òptic del microscopi.Col·loqueu immediatament una gota de la mostra a la piscina de líquid i col·loqueu-la al voladís amb una xeringa de plàstic d'un sol ús estèril i una agulla estèril.Una altra gota es col·loca directament sobre la mostra, i quan es baixa el capçal òptic, les dues gotes es fusionen, formant un menisc entre la mostra i el dipòsit de líquid.Les mesures AFM es van realitzar mitjançant un voladís de nitrur en forma de V SCANASYST-FLUID (Bruker, duresa k = 0, 7 N m-1, f0 = 120–180 kHz).
Els cromatogrames HPLC es van obtenir en un sistema Waters e2695 equipat amb una columna Phoenix C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm) mitjançant un detector 2489 UV/Vis.La longitud d'ona del detector és de 650 nm.Les fases mòbils A i B eren aigua i metanol, respectivament, i el cabal de la fase mòbil era d'1,0 ml·min-1.El gradient (solvent B) va ser el següent: 100% de 0 a 4 minuts, 100% a 50% de 5 a 30 minuts i restabliment al 100% de 31 a 40 minuts.El mineral es va dissoldre en una solució mixta de metanol i aigua (50/50, en volum) a una concentració de 50 μM.El volum d'injecció era de 20 μl.
Els assajos GPC es van registrar en un instrument Thermo ULTIMATE 3000 equipat amb dues columnes PL aquagel-OH MIXED-H (2 × 300 × 7,5 mm, 8 µm) i un detector d'índex de refracció ERC RefratoMax520.La columna GPC es va eluir amb aigua a un cabal d'1 ml/min a 30 ° C.Els NP de mineral es van dissoldre en solució de PBS (pH = 7, 4, 50 μM), el volum d'injecció era de 20 μL.
Els fotocorrents es van mesurar en una configuració electroquímica (CHI-660B, Xina).Les respostes optoelectròniques quan es va encendre i apagar el làser (808 nm, 0, 5 W/cm2) es van mesurar a una tensió de 0, 5 V en una caixa negra, respectivament.Es va utilitzar una cèl·lula estàndard de tres elèctrodes amb un elèctrode de carboni vidre en forma de L (GCE) com a elèctrode de treball, un elèctrode de calomel estàndard (SCE) com a elèctrode de referència i un disc de platí com a contraelèctrode.Es va utilitzar una solució de Na2SO4 0,1 M com a electròlit.
La línia cel·lular de càncer de mama humà MDA-MB-231 es va comprar a KeyGEN Biotec Co., LTD (Nanjing, Xina, número de catàleg: KG033).Les cèl·lules es van cultivar en monocapes en el medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM, glucosa alta) complementat amb una solució de sèrum boví fetal al 10% (FBS), penicil·lina (100 μg/ml) i estreptomicina (100 μg/ml).Totes les cèl·lules es van cultivar a 37 ° C en una atmosfera humida que contenia un 5% de CO2.
El test MTT es va utilitzar per determinar la citotoxicitat de RuDA i RuDA-NP en presència i absència d'irradiació lumínica, amb o sense Vc (0, 5 mM).Les cèl·lules canceroses MDA-MB-231 es van cultivar en plaques de 96 pous a una densitat cel·lular d'aproximadament 1 x 105 cèl·lules/ml/pou i es van incubar durant 12 hores a 37, 0 ° C en una atmosfera de 5% CO2 i 95% d'aire.Es van afegir RuDA i RuDA NP dissolts en aigua a les cèl·lules.Després de 12 hores d'incubació, les cèl·lules es van exposar a una radiació làser de 0,5 W cm -2 a una longitud d'ona de 808 nm durant 10 minuts (300 J cm -2) i després es van incubar a la foscor durant 24 hores.A continuació, es van incubar les cèl·lules amb MTT (5 mg/ml) durant 5 hores més.Finalment, canvieu el medi a DMSO (200 µl) per dissoldre els cristalls de formazan morats resultants.Els valors de DO es van mesurar mitjançant un lector de microplaques amb una longitud d'ona de 570/630 nm.El valor IC50 de cada mostra es va calcular mitjançant el programari SPSS a partir de corbes dosi-resposta obtingudes a partir d'almenys tres experiments independents.
Les cèl·lules MDA-MB-231 es van tractar amb RuDA i RuDA-NP a una concentració de 50 μM.Després de 12 hores d'incubació, les cèl·lules es van irradiar amb un làser amb una longitud d'ona de 808 nm i una potència de 0,5 W/cm2 durant 10 min (300 J/cm2).Al grup de vitamina C (Vc), les cèl·lules es van tractar amb 0,5 mM de Vc abans de la irradiació làser.Les cèl·lules es van incubar a la foscor durant 24 hores addicionals, després es van tacar amb calceïna AM i iodur de propidi (20 μg/ml, 5 μl) durant 30 minuts i després es van rentar amb PBS (10 μl, pH 7, 4).imatges de cèl·lules tenyides.
Hora de publicació: 23-set-2022
