Gràcies per visitar Nature.com.La versió del navegador que utilitzeu té un suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).Mentrestant, per garantir un suport continuat, renderitzarem el lloc sense estils ni JavaScript.
Els mètodes d'etiquetatge enzimàtic de proximitat basats en èsters activats o radicals fenoxi s'utilitzen àmpliament per mapejar proteomes subcel·lulars i interactors de proteïnes en cèl·lules vives.Tanmateix, els èsters activats són menys reactius, donant lloc a un ampli radi d'etiquetatge, i els radicals fenoxi generats pel tractament amb peròxid poden interferir amb les vies redox.Aquí informem d'un mètode de fotoactivació dependent de l'etiquetatge de proximitat (PDPL) desenvolupat enllaçant genèticament la proteïna fotosensibilitzadora miniSOG amb una proteïna d'interès.Activat per la llum blava i controlat pel temps d'exposició, es genera oxigen singlet i després s'aconsegueix l'etiquetatge resolt espacialment dels residus d'histidina per la sonda d'anilina.Demostrem la seva alta fidelitat mitjançant el mapeig de proteomes específics d'orgànuls.Una comparació paral·lela de PDPL amb TurboID mostra una cobertura proteòmica més específica i completa de PDPL.A continuació, vam aplicar PDPL al coactivador transcripcional BRD4 i E3 Parkin ligasa associat a la malaltia i vam trobar interactors desconeguts anteriorment.Mitjançant el cribratge de sobreexpressió, es van identificar dos substrats desconeguts, Ssu72 i SNW1, per a Parkin, la degradació del qual està mediada per la via d'ubiqüitinació-proteasoma.
La caracterització precisa de les xarxes de proteïnes és la base de molts processos cel·lulars fonamentals.Per tant, un mapatge espai-temporal altament precís de les interaccions de proteïnes proporcionarà una base molecular per desxifrar vies biològiques, patologia de la malaltia i interrompre aquestes interaccions amb finalitats terapèutiques.Amb aquesta finalitat, són molt desitjables mètodes capaços de detectar interaccions temporals en cèl·lules o teixits vius.Històricament s'ha utilitzat l'espectrometria de masses per purificació d'afinitat (AP-MS) per identificar socis d'unió de proteïnes d'interès (POI).Amb el desenvolupament de mètodes de proteòmica quantitativa, es va crear Bioplex3.0, la base de dades més gran de xarxes de proteïnes basades en AP-MS.Tot i que l'AP-MS és molt potent, els passos de lisi i dilució cel·lular en el flux de treball estan esbiaixats cap a interaccions d'unió febles i transitòries i introdueixen artefactes posteriors a la lisi, com ara parells d'interacció espúria que no tenen compartimentació abans de la lisi.
Per abordar aquests problemes, s'han desenvolupat aminoàcids no naturals (UAA) amb grups de reticulació i plataformes d'etiquetatge proper enzimàtic (PL) (per exemple, APEX i BioID)5.Tot i que el mètode UAA s'ha aplicat amb èxit en molts escenaris i proporciona informació sobre adhesius proteics directes, encara és necessària l'optimització del lloc d'inserció de la UAA.Més important encara, és un mètode d'etiquetatge estequiomètric que no té una inversió catalítica dels esdeveniments d'etiquetatge.En canvi, els mètodes enzimàtics de PL, com el mètode BioID, fusionen la biotina lligasa dissenyada amb POI7, que posteriorment activa la biotina per formar un intermedi èster biotinil-AMP reactiu.Així, l'enzim catalitza i allibera un "núvol" de biotina activat que marca els residus de lisina proximals.No obstant això, BioID requereix més de 12 hores per obtenir un senyal etiquetat suficient, cosa que impedeix el seu ús amb resolució temporal.Mitjançant l'evolució dirigida basada en la visualització de llevats, TurboID es va dissenyar basant-se en BioID per ser més eficient, permetent un etiquetatge eficient amb biotina en 10 minuts, permetent estudiar processos més dinàmics.Com que TurboID és molt actiu i els nivells de biotina endògens són suficients per a l'etiquetatge de baix nivell, l'etiquetatge de fons es converteix en un problema potencial quan es requereix un etiquetatge molt millorat i cronometrat per l'addició de biotina exògena.A més, els èsters activats són poc reactius (t1/2 ~ 5 min), cosa que pot conduir a un gran radi d'etiquetatge, especialment després de la saturació de proteïnes veïnes amb biotina 5. En un altre enfocament, la fusió genètica d'ascorbat peroxidasa (és a dir, biotina radicals fenols i permet l'etiquetatge de proteïnes en un minut9, 10. L'APEX s'utilitza àmpliament per identificar proteomes subcel·lulars, complexos de proteïnes de membrana i complexos de proteïnes de senyalització citosòliques. processos cel·lulars.
Així, un nou mètode capaç de generar espècies de supressió de radi marcat més reactives amb una alta precisió espacial i temporal sense interrompre significativament les vies cel·lulars serà una addició important als mètodes existents. Entre les espècies reactives, l'oxigen singlet va despertar la nostra atenció per la seva curta vida útil i el seu radi de difusió limitat (t1/2 < 0,6 µs a les cèl·lules)13. Entre les espècies reactives, l'oxigen singlet va despertar la nostra atenció per la seva curta vida útil i el seu radi de difusió limitat (t1/2 < 0,6 µs a les cèl·lules)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Entre les formes actives, l'oxigen singlet va cridar la nostra atenció per la seva curta vida útil i el seu radi de difusió limitat (t1/2 < 0,6 µs a les cèl·lules)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs 其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs（3 µs（ 1 µs） 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Entre les formes actives, l'oxigen singlet crida la nostra atenció per la seva curta vida útil i el seu radi de difusió limitat (t1/2 < 0, 6 μs a les cèl·lules).S'ha informat que l'oxigen singlet oxida aleatòriament la metionina, la tirosina, la histidina i el triptòfan, fent-lo polar 14,15 per a la connexió a sondes basades en amina o tiol16,17.Tot i que s'ha utilitzat l'oxigen singlet per etiquetar l'ARN del compartiment subcel·lular, les estratègies per reutilitzar els marcadors de proximitat de POI endògens continuen sense explorar-se.Aquí, presentem una plataforma anomenada etiquetatge de proximitat depenent de la fotoactivació (PDPL), on utilitzem llum blava per il·luminar els PDI fusionats amb un fotosensibilitzador miniSOG i desencadenar la generació d'oxigen singlet per oxidar els residus proximals, seguit de modificacions que contenen amines per oxidar sondes químiques a cèl·lules vives intermèdies..Vam provar un grup de sondes químiques per maximitzar l'especificitat de l'etiqueta i vam identificar llocs de modificació mitjançant un flux de treball de proteòmica obert.Una comparació paral·lela de PDPL amb TurboID mostra una cobertura proteòmica més específica i completa de PDPL.Hem aplicat aquest enfocament als marcadors específics dels orgànuls del proteoma subcel·lular i a la identificació general del proteoma dels socis d'unió per a la proteïna reguladora epigenètica associada al càncer BRD4 i la lligasa E3 Parkin associada a la malaltia de Parkinson, que va confirmar una xarxa de proteïnes coneguda i una desconeguda. interaccions..La capacitat del PDPL per reconèixer substrats E3 en grans complexos proteics representa una situació en què es requereix el reconeixement dels aglutinants indirectes.S'han confirmat in situ dos substrats de parkin desconeguts mediats per la ubiquitinació-proteasoma.
La teràpia fotodinàmica (PDT)19 i la inactivació làser assistida per cromòfors (CALI)20, en què la irradiació de llum amb fotosensibilitzadors genera oxigen singlet, pot inactivar proteïnes diana o provocar la mort cel·lular.Com que l'oxigen singlet és una substància altament reactiva amb una distància de difusió teòrica d'uns 70 nm, es pot controlar l'oxidació espacialment limitada al voltant del fotosensibilitzador.A partir d'aquest concepte, vam decidir utilitzar l'oxigen singlet per aconseguir un etiquetatge proper dels complexos proteics a les cèl·lules vives.Hem desenvolupat un enfocament quimioproteòmic PDPL per complir quatre funcions: (1) catalitzar la generació d'oxigen singlet actiu similar a l'enfocament enzimàtic PL;(2) proporcionar un etiquetatge resolt en el temps a l'inici de la llum;(3) per alteració (4) Eviteu utilitzar cofactors endògens (com la biotina) per reduir el fons, o utilitzeu reactius exògens molt pertorbadors (com ara peròxids) per minimitzar l'exposició cel·lular a l'estrès ambiental.
Els fotosensibilitzadors es poden dividir en dues categories, incloent fluoròfors de pes molecular petit (per exemple, rosa de bengala, blau de metilè)22 i proteïnes petites codificades genèticament (per exemple, miniSOG, KillerRed)23.Per aconseguir un disseny modular, vam desenvolupar la plataforma PDPL de primera generació afegint proteïnes fotosensibilitzadores (PS) a POI24,25 (figura 1a).Quan s'irradia amb llum blava, l'oxigen singlet oxida els residus d'aminoàcids nucleòfils proximals, donant lloc a una polaritat umpolung que és electròfila i pot reaccionar encara més amb els nucleòfils de la sonda d'amina16,17.La sonda està dissenyada amb un mànec alquin per permetre fer clic i tirar cap avall per a la caracterització LC/MS/MS.
Il·lustració esquemàtica de l'etiquetatge de complexos proteics mediat per miniSOG.Quan s'exposen a la llum blava, les cèl·lules que expressen miniSOG-POI generen oxigen singlet, que modifica les proteïnes que interactuen però no les proteïnes no vinculants.Els productes intermedis de la fotooxidació són interceptats per etiquetes de relé de la sonda química amina per formar adductes covalents.El grup alquinil de la sonda química permet fer clic a la química per a l'enriquiment mitjançant un desplegable seguit de la quantificació LC-MS/MS.b Estructura química de les sondes d'amina 1-4.c Anàlisi representativa de gel fluorescent de marcadors proteòmics mediats per miniSOG localitzats mitocondrials mitjançant sondes 1-4 i quantificació relativa basada en densitometria en gel.La relació senyal-fons de les sondes químiques es va avaluar mitjançant experiments de control negatiu excloent la llum blava o utilitzant cèl·lules HEK293T sense expressió miniSOG.n = 2 mostres biològicament independents.Cada punt representa una rèplica biològica.d Detecció i quantificació representatives de PDPL mitjançant la sonda optimitzada 3 en presència o absència dels components PDPL indicats com c.n = 3 mostres biològicament independents.Cada punt representa una rèplica biològica.Les línies centrals i els bigotis representen la mitjana i la desviació estàndard ±.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Imatge confocal d'oxigen singlet amb tinció de Si-DMA de color vermell llunyà.Barra d'escala: 10 µm.Els experiments d'imatge en gel i confocals es van repetir de manera independent almenys dues vegades amb resultats similars.
Primer vam provar la capacitat dels fotosensibilitzadors madurs miniSOG26 i KillerRed23, expressats de manera estable a HEK293T, per mediar l'etiquetatge de propargilamina del proteoma com a sonda química (figura suplementària 1a).L'anàlisi de fluorescència en gel va mostrar que l'etiquetatge del proteoma sencer es va aconseguir mitjançant miniSOG i irradiació de llum blava, mentre que no es va observar cap producte d'etiquetatge visible amb KillerRed.Per millorar la relació senyal-fons, vam provar un conjunt de sondes químiques que contenien anilina (1 i 3), propilamina (2) o benzilamina (4).Vam observar que les mateixes cèl·lules HEK293T tenien un senyal de fons més alt en comparació amb cap llum blava, possiblement a causa del fotosensibilitzador endògen de riboflavina, el mononucleòtid de flavina (FMN) 27 . Les sondes químiques basades en anilina 1 i 3 van donar una millor especificitat, amb HEK293T que expressava de manera estable miniSOG als mitocondris mostrant un augment > 8 vegades del senyal per a la sonda 3, mentre que la sonda 2 utilitzada en el mètode d'etiquetatge d'ARN CAP-seq només mostra ~ 2,5- augment del senyal de vegades, probablement a causa de diferents preferències de reactivitat entre l'ARN i la proteïna (Fig. 1b, c). Les sondes químiques basades en anilina 1 i 3 van donar una millor especificitat, amb HEK293T que expressava de manera estable miniSOG als mitocondris mostrant un augment > 8 vegades del senyal per a la sonda 3, mentre que la sonda 2 utilitzada en el mètode d'etiquetatge d'ARN CAP-seq només mostra ~ 2,5- augment del senyal de vegades, probablement a causa de diferents preferències de reactivitat entre l'ARN i la proteïna (Fig. 1b, c).Les sondes químiques 1 i 3 basades en anilina van mostrar una millor especificitat: HEK293T, que expressa de manera estable miniSOG als mitocondris, mostra un augment de més de 8 vegades en el senyal per a la sonda 3, mentre que la sonda 2, utilitzada en el mètode d'etiquetatge d'ARN CAP-seq, només mostra un augment del senyal de ~ 2, 5 vegades, probablement a causa de diferents preferències de reactivitat entre l'ARN i la proteïna (Fig. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 ， hek293t 在 线 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加> 8 倍 ， 用 于 于 rna 标记 方法 cap-seq 的 探针 2 显示 显示 ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 Minisog ， 探针 3 的 信号 增加> 8 倍 而 于 于 RNA 标记 Cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNALes sondes químiques 1 i 3 basades en anilina tenien una millor especificitat, HEK293T va expressar de manera estable miniSOG als mitocondris i la sonda 3 va tenir un augment de més de 8 vegades en el senyal, mentre que la sonda 2 per al mètode d'etiquetatge d'ARN CAP-seq va mostrar només un augment de ~ 2, 5 vegades.en el senyal, probablement a causa de diferents preferències de reacció entre l'ARN i la proteïna (Fig. 1b, c).A més, es van provar els isòmers de la sonda 3 i les sondes d'hidrazina (sondes 5, 6, 7), confirmant l'optimització de la sonda 3 (figura suplementària 1b, c).De la mateixa manera, l'anàlisi de fluorescència en gel va revelar altres paràmetres experimentals optimitzats: longitud d'ona d'irradiació (460 nm), concentració de la sonda química (1 mM) i temps d'irradiació (20 min) (figura suplementària 2a-c).L'omissió de qualsevol component o pas del protocol PDPL va donar lloc a una inversió significativa del senyal al fons (Fig. 1d).En particular, l'etiquetatge de proteïnes es va reduir significativament en presència d'azida de sodi o trolox, que se sap que apaguen l'oxigen singlet.La presència de D2O, que se sap que estabilitza l'oxigen singlet, millora el senyal d'etiquetatge.Per investigar la contribució d'altres espècies reactives d'oxigen a l'etiquetatge, es van afegir manitol i vitamina C per establir eliminadors de radicals hidroxil i superòxid, respectivament, 18, 29, però no es va trobar que reduïssin l'etiquetatge.L'addició d'H2O2, però no la il·luminació, no va donar lloc a l'etiquetatge (figura suplementària 3a).Les imatges d'oxigen singlet de fluorescència amb sondes Si-DMA van confirmar la presència d'oxigen singlet al cable HEK293T-miniSOG, però no al cable HEK293T original.A més, mitoSOX Red no va poder detectar la producció de superòxid després de la il·luminació (Fig. 1e i Fig. 3b suplementària) 30. Aquestes dades suggereixen fortament que l'oxigen singlet és la principal espècie reactiva d'oxigen responsable de l'etiquetatge proteòmic posterior.Es va avaluar la citotoxicitat de PDPL incloent irradiació de llum blava i sondes químiques, i no es va observar cap citotoxicitat significativa (figura suplementària 4a).
Per estudiar el mecanisme d'etiquetatge i permetre la identificació proteòmica de complexos proteics mitjançant LC-MS/MS, primer hem de determinar quins aminoàcids es modifiquen i la massa delta de les etiquetes de la sonda.S'ha informat que la metionina, la histidina, el triptòfan i la tirosina estan modificades per l'oxigen singlet14,15.Integrem el flux de treball TOP-ABPP31 amb la cerca oberta imparcial proporcionada per la plataforma informàtica FragPipe basada en MSFragger32.Després de la modificació de l'oxigen singlet i l'etiquetatge de la sonda química, es va realitzar la química del clic mitjançant una etiqueta de reducció de biotina que contenia un enllaç escindible, seguida d'estirament de neutravidina i digestió de tripsina.El pèptid modificat, encara lligat a la resina, es va fotocliva per a l'anàlisi LC-MS/MS (figura 2a i dades suplementàries 1).Es van produir un gran nombre de modificacions al proteoma amb més de 50 coincidències de mapes de pèptids (PSM) enumerades (Fig. 2b).Sorprenentment, només vam observar modificacions de la histidina, probablement a causa de la major reactivitat de la histidina oxidada cap a sondes d'anilina que altres aminoàcids.Segons el mecanisme publicat d'oxidació de la histidina per oxigen singlet21,33, l'estructura delta-massa proposada de +229 Da correspon a l'aducte de la sonda 3 amb 2-oxo-histidina després de dues oxidacions, mentre que +247 Da és el producte de la hidròlisi. de +229 Da (figura suplementària 5).L'avaluació de l'espectre MS2 va mostrar una alta fiabilitat en la identificació de la majoria dels ions y i b, inclosa la identificació d'ions de fragments modificats (y i b) (Fig. 2c).L'anàlisi del context de la seqüència local d'histidines modificades amb PDPL va revelar una preferència de motiu moderada per a petits residus hidrofòbics a ± 1 posicions (figura suplementària 4b).De mitjana, es van identificar 1, 4 histidines per proteïna i els llocs d'aquests marcadors es van determinar mitjançant l'anàlisi de la superfície accessible a dissolvents (SASA) i la disponibilitat relativa de dissolvents (RSA) (figura suplementària 4c, d).
Un flux de treball imparcial per estudiar la selectivitat residual mitjançant la plataforma informàtica FragPipe impulsada per MSFragger.Els enllaços escindibles s'utilitzen en la química Click per permetre la fotoescissió de pèptids modificats a partir de la resina d'estreptavidina.Es va iniciar una cerca oberta per identificar nombroses modificacions, així com restes rellevants.b Assigna la massa de modificacions que es produeixen al llarg del proteoma.Mapeig de pèptids PSM.c Anotació espectral MS2 dels llocs d'histidina modificats amb la sonda 3. Com a exemple representatiu, una reacció covalent amb la sonda 3 va afegir +229,0938 Da a l'aminoàcid modificat.d Assaig de mutació utilitzat per provar marcadors PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) i PRDX1 (H10A, H81A, H169A) es van transfectar amb plasmidis de tipus salvatge per a la detecció anti-Flag.e El pèptid sintètic es va fer reaccionar amb miniSOG purificat en presència de la sonda 3 i es van observar els productes corresponents amb Δm +247 i +229 a l'espectre LC-MS.f Interaccions proteïna-proteïna in vitro modelades amb miniSOG-6xHis-tag i anticossos anti-6xHis.Anàlisi d'antibiotina (estreptavidina-HRP) i Western blot anti-ratolí de complexos d'anticossos miniSOG-6xHis/anti-6xHis marcats amb la sonda 3, depenent del temps d'exposició a la llum.Les etiquetes de proteïnes individuals s'expressen en el pes molecular corresponent: cadena lleugera d'anticossos LC, cadena pesada d'anticossos HC.Aquests experiments es van repetir de manera independent almenys dues vegades amb resultats similars.
Per a la verificació bioquímica del lloc d'etiquetatge, PRDX3 i PRDX1 identificats per espectrometria de masses es van canviar d'histidina a alanina i es van comparar amb el tipus salvatge en assajos de transfecció.Els resultats del PDPL van mostrar que la mutació va reduir significativament l'etiquetatge (Fig. 2d).Mentrestant, les seqüències de pèptids identificades a la cerca oberta es van sintetitzar i van reaccionar in vitro amb miniSOG purificat en presència de la sonda 3 i la llum blava, produint productes amb un desplaçament de massa de +247 i +229 Da quan es van detectar per LC-MS (Fig. .2e).).Per provar si les proteïnes proximals que interaccionen es podrien etiquetar in vitro en resposta a la fotoactivació miniSOG, vam dissenyar un assaig de proximitat artificial mitjançant la interacció entre la proteïna miniSOG-6xHis i un anticòs monoclonal anti-His in vitro (figura 2f).En aquest assaig, esperàvem un etiquetatge proximal de cadenes pesades i lleugeres d'anticossos amb miniSOG.De fet, l'anti-ratolí (reconeixent les cadenes pesades i lleugeres de l'anticòs marcat amb anti-6xHis) i les taques occidentals d'estreptavidina van mostrar una forta biotinilació de les cadenes pesades i lleugeres.En particular, vam notar l'autobiotinilació miniSOG a causa de l'etiqueta 6xHis i els enllaços creuats entre cadenes lleugeres i pesades, que poden estar relacionades amb la bretxa descrita anteriorment entre la resposta proximal de la lisina i la 2-oxo-histidina.En conclusió, concloem que PDPL modifica la histidina de manera dependent de la proximitat.
El nostre següent objectiu va ser caracteritzar el proteoma subcel·lular per provar l'especificitat de l'etiquetatge in situ.Per tant, vam expressar de manera estable miniSOG al nucli, la matriu mitocondrial o la membrana ER externa de les cèl·lules HEK293T (Fig. 3a).L'anàlisi de fluorescència en gel va revelar abundants bandes marcades en tres ubicacions subcel·lulars, així com diferents patrons d'etiquetatge (Fig. 3b).L'anàlisi d'imatges de fluorescència va mostrar una alta especificitat de PDPL (Fig. 3c).El flux de treball PDPL va ser seguit de reaccions de clic amb colorants de rodamina per delimitar proteomes subcel·lulars mitjançant microscòpia de fluorescència, i els senyals PDPL es van colocalitzar amb DAPI, rastrejadors mitocondrials o rastrejadors ER, confirmant l'alta fidelitat de PDPL.Per a les tres ubicacions dels orgànuls, una comparació paral·lela de PDPL amb TurboID mitjançant avidina western blot va mostrar que PDPL estava etiquetat de manera més específica en comparació amb els seus respectius controls.En condicions de PDPL, van aparèixer més bandes marcades, cosa que indicava més proteïnes marcades amb PDPL (figura suplementària 6a-d).
una Representació esquemàtica de l'etiquetatge del proteoma específic d'orgànuls mediat per miniSOG.miniSOG s'adreça a la matriu mitocondrial mitjançant la fusió als 23 aminoàcids N-terminals de la COX4 humana (mito-miniSOG), el nucli mitjançant la fusió a H2B (nucli-miniSOG) i Sec61β a través del costat citoplasmàtic de la membrana ER (ER-miniSOG). ).Les indicacions inclouen imatges en gel, imatges confocals i espectrometria de masses.b Imatges de gel representatives de tres perfils PDPL específics per a orgànuls.CBB Coomassie Blau brillant.c Imatges confocals representatives de cèl·lules HEK293T que expressen de manera estable miniSOG amb diferents localitzacions subcel·lulars detectades per anticossos marcats amb V5 (vermell).Els marcadors subcel·lulars s'utilitzen per als mitocondris i ER (verd).El flux de treball PDPL inclou la detecció de proteomes subcel·lulars etiquetats amb miniSOG (groc) mitjançant la química de clics de Cy3-azide.Barra d'escala: 10 µm.d Gràfics volcànics de proteomes marcats amb PDPL en diversos orgànuls quantificats per quantificació sense etiquetar (n = 3 experiments biològics independents).La prova t de Student de dues cues es va utilitzar en parcel·les de volcans.El tipus salvatge HEK293T es va utilitzar com a control negatiu. Les proteïnes que han canviat significativament es destaquen en vermell (p < 0, 05 i diferència d'intensitat d'ions > 2 vegades). Les proteïnes que han canviat significativament es destaquen en vermell (p < 0, 05 i diferència d'intensitat d'ions > 2 vegades). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интесни в интесно). Les proteïnes significativament alterades es destaquen en vermell (p < 0, 05 i diferència > 2 vegades en la intensitat dels ions).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 i > 2-кратная разница в исница в ионлной). Les proteïnes significativament alterades es destaquen en vermell (p < 0, 05 i > 2 vegades la diferència de força iònica).Les proteïnes relacionades importants per a HEK293T-miniSOG però no importants per a HEK293T es mostren en verd.e Anàlisi de l'especificitat dels conjunts de dades proteòmiques dels experiments d.El nombre total de proteïnes estadísticament significatives a cada orgànul (punts vermells i verds) està marcat a la part superior.Els histogrames mostren proteïnes localitzades en orgànuls basats en MitoCarta 3.0, anàlisi GO i A. Ting et al.gent.Conjunts de dades separats per a mitocondris, nuclis i ER.Aquests experiments es van repetir de manera independent almenys dues vegades amb resultats similars.Les dades en brut es proporcionen en forma de fitxers de dades en brut.
Encoratjat pels resultats del gel i la imatge, es va utilitzar la quantificació sense etiquetes per quantificar el proteoma identificat a cada orgànul (dades suplementàries 2).L'HEK293T no transfectat es va utilitzar com a control negatiu per restar marcadors de fons. L'anàlisi de la trama del volcà va mostrar proteïnes significativament enriquides (p <0, 05 i > 2 vegades d'intensitat d'ions), així com proteïnes singleton que només estan presents a les línies que expressen miniSOG (Fig. 3d punts vermells i verds). L'anàlisi de la trama del volcà va mostrar proteïnes significativament enriquides (p <0, 05 i > 2 vegades d'intensitat d'ions), així com proteïnes singleton que només estan presents a les línies que expressen miniSOG (Fig. 3d punts vermells i verds). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). L'anàlisi de la trama del volcà va mostrar proteïnes significativament enriquides (p <0, 05 i > 2 vegades d'intensitat iònica), així com proteïnes individuals que només estan presents a les línies que expressen miniSOG (Fig. 3d, punts vermells i verds).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 以及 仅 存 在于 Minisog 表达 系 的 单一 单一 （图 3d 红色 和 绿色点））））））））））））））））））））。。。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （（p <0,05 和> 2 倍 强度）） 仅 存 在于 在于 Minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3D 红色 。。。）））））） اV Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). L'anàlisi de la trama del volcà va revelar proteïnes significativament enriquides (p <0, 05 i> 2x força iònica), així com proteïnes individuals només presents a la línia d'expressió miniSOG (punts vermells i verds a la figura 3d).Combinant aquestes dades, vam identificar 1364, 461 i 911 proteïnes de membrana externa nuclear, mitocondrial i ER estadísticament significatives, respectivament.Per analitzar la precisió del PDPL localitzat en orgànuls, hem utilitzat MitoCarta 3.0, l'anàlisi d'ontologia genètica (GO) i A. Ting et al.es va utilitzar un conjunt de dades8 per als mitocondris, el nucli i l'ER per provar l'especificitat dels orgànuls de les proteïnes detectades, corresponent a una precisió del 73,4, 78,5 i 73,0% (Fig. 3e).L'especificitat de PDPL confirma que PDPL és una eina ideal per identificar proteomes específics d'orgànuls.En particular, l'anàlisi submitocondrial de proteïnes mitocondrials identificades va mostrar que el proteoma atrapat es distribuïa principalment a la matriu i la membrana interna (226 i 106, respectivament), representant el 91, 7% (362) del nombre total de proteïnes mitocondrials identificades.també es va confirmar un alt nivell de PDPL (figura suplementària 7a).De la mateixa manera, l'anàlisi subnuclear va mostrar que el proteoma capturat es distribuïa principalment al nucli, al nucleoplasma i al nucli (figura suplementària 7b).L'anàlisi proteòmica nuclear amb un pèptid senyal de localització nuclear (3xNLS) va mostrar una precisió similar a la de la construcció H2B (figura suplementària 7c–h).Per determinar l'especificitat del marcador PDPL, es va escollir la laminina nuclear A com a trampa POI7 localitzada més discretament.PDPL va identificar 36 proteïnes significativament enriquides, de les quals 12 proteïnes (el 30,0% inclosa la lamina A) eren proteïnes que interactuen amb lamina A ben caracteritzades anotades per la base de dades String, amb un percentatge més elevat que el mètode BioID (122 proteïnes) 28 de 28. , 22,9 %) 7. El nostre mètode va identificar menys proteïnes, possiblement a causa d'àrees limitades d'etiquetatge, fet que va ser possible gràcies a un oxigen singlet més actiu.L'anàlisi GO va mostrar que les proteïnes identificades es van localitzar principalment al nucleoplasma (26), la membrana nuclear (10), la membrana nuclear (9) i els porus nuclears (5).Col·lectivament, aquestes proteïnes localitzades nuclearment representaven el 80% de les proteïnes enriquides, demostrant encara més l'especificitat de PDPL (figura suplementària 8a-d).
Després d'haver establert la capacitat del PDPL per realitzar el marcatge de proximitat als orgànuls, vam provar si el PDPL es podia utilitzar per analitzar els socis d'unió de POI.En particular, hem intentat definir l'anàlisi PDPL de proteïnes citosòliques, que es consideren objectius més difícils que els seus homòlegs localitzats a la membrana a causa de la seva naturalesa altament dinàmica.La proteïna bromodomain i extraterminal (BET) BRD4 ha cridat la nostra atenció pel seu paper clau en diverses malalties 35, 36.El complex format per BRD4 és un coactivador transcripcional i una diana terapèutica important.En regular l'expressió dels factors de transcripció c-myc i Wnt5a, es creu que BRD4 és un determinant clau de la leucèmia mieloide aguda (AML), el mieloma múltiple, el limfoma de Burkitt, el càncer de còlon i les malalties inflamatòries37,38.A més, alguns virus es dirigeixen a BRD4 per regular la transcripció viral i cel·lular, com el virus del papil·loma, el VIH i el SARS-CoV-236,39.
Per mapejar la interacció BRD4 mitjançant PDPL, vam combinar miniSOG amb una isoforma N- o C-terminal curta de BRD4.Els resultats proteòmics van revelar un alt grau de superposició entre les dues construccions (figura suplementària 9a).El proteoma nuclear identificat amb miniSOG-H2B cobreix el 77, 6% de les proteïnes que interaccionen amb BRD4 (figura suplementària 9b).A continuació, es van utilitzar diferents temps d'il·luminació (2, 5, 10, 20 min) per ajustar el radi del marcador (Fig. 4a i dades suplementàries 3).Arribem a la conclusió que en fotoperíodes més curts, el PDPL marcarà principalment els socis d'unió directa, mentre que els períodes més llargs inclouran proteïnes identificades durant períodes de fotoactivació més curts, així com dianes indirectes en complexos d'etiquetatge.De fet, vam trobar una forta superposició entre punts de temps adjacents (84, 6% durant 2 i 5 min; 87, 7% durant 5 i 10 min; 98, 7% durant 10 i 20 min) (Fig. 4b i Fig. 9c suplementària).En tots els grups experimentals, no només vam trobar l'autoetiquetatge BRD4, sinó també diversos objectius coneguts com MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A i HMGB1 anotats a la base de dades de cadenes.La força iònica d'aquests objectius és proporcional al temps d'exposició (figura 4c i figura suplementària 9d).L'anàlisi GO de les proteïnes identificades en el grup de 2 minuts va mostrar que les proteïnes identificades estaven localitzades al nucli i estaven implicades en la remodelació de la cromatina i la funció de la ARN polimerasa.La funció molecular de la proteïna es va enriquir en la unió de la cromatina o la coactivació transcripcional, d'acord amb la funció BRD4 (Fig. 4d).L'anàlisi d'interacció de proteïnes habilitada per bases de dades de cadenes va revelar un primer nivell d'interaccions indirectes entre complexos d'interacció de la família BRD4 i HDAC com SIN3A, NCOR2, BCOR i SAP130 (Fig. 4e i Fig. 9e suplementària), coherent amb les histones acetilades que uneixen BRD4 i HDAC. ..A més, els objectius representatius identificats per LC-MS/MS, inclosos Sin3A, NSUN2, Fus i SFPQ, es van confirmar mitjançant Western Blotting (Fig. 4f).Recentment, s'ha informat que la isoforma curta de BRD4 forma nuclis amb propietats de separació de fase líquid-líquid (LLPS).Les proteïnes d'unió a l'ARN Fus i SFPQ medien els LLPS de diversos processos cel·lulars i s'han identificat aquí com a proteïnes d'unió BRD4 no registrades.La interacció entre BRD4 i SFPQ es va confirmar mitjançant experiments de co-immunoprecipitació (co-IP) (figura 4g), cosa que suggereix un altre mecanisme per a la separació de fase líquid-líquid mediada per BRD4 que mereix una investigació addicional.En conjunt, aquests resultats suggereixen que PDPL és una plataforma ideal per identificar les interaccions conegudes de BRD4, així com les proteïnes d'unió desconegudes.
a Representació esquemàtica del marcatge de proximitat BRD4 mediat per miniSOG, temps d'exposició: 2, 5, 10 i 20 min.b Superposició de proteïnes identificades en diferents moments d'il·luminació.L'enriquiment de proteïnes identificat a HEK293T-miniSOG-BRD4 va ser estadísticament significatiu en comparació amb HEK293T de tipus salvatge.c Intensitat dels ions quan es quantifiquen proteïnes d'unió a BRD4 representatives no marcades conegudes durant el temps d'exposició especificat.n = 3 mostres biològicament independents.Les dades es presenten com a mitjana ± desviació estàndard.d Anàlisi ontològica gènica (GO) de proteïnes identificades en el grup de 2 minuts.S'enumeren els deu primers termes GO.Les bombolles estan acolorides segons la categoria del terme GO i la mida de la bombolla és proporcional al nombre de proteïnes que es troben en cada terme.e Anàlisi de cadenes de proteïnes que interaccionen amb BRD4.Els cercles grocs són cola directa i els cercles grisos són la primera capa de cola indirecta.Les línies vermelles representen les interaccions determinades experimentalment i les línies blaves representen les interaccions previstes.f Els objectius d'unió BRD4 representatius identificats a LC-MS/MS es van verificar mitjançant Western blotting.g Els experiments de co-immunoprecipitació confirmen la interacció entre SFPQ i BRD4.Aquests experiments es van repetir de manera independent almenys dues vegades amb resultats similars.Les dades en brut es proporcionen en forma de fitxers de dades en brut.
A més d'identificar objectius associats a POI no registrats, suposem que PDPL serà adequat per identificar substrats per a enzims, cosa que requeriria la caracterització de proteïnes d'unió indirecta en grans complexos per anotar substrats no registrats.La parkin (codificada per PARK2) és una lligasa E3 i se sap que les mutacions a la parkin causen la malaltia de Parkinson juvenil autosòmica recessiva (AR-JP)42.A més, s'ha descrit la parkin com a essencial per a la mitofagia (autofàgia mitocondrial) i l'eliminació d'espècies reactives d'oxigen.Tanmateix, tot i que s'han identificat diversos substrats de parkin, el paper de la parkin en aquesta malaltia encara no està clar.Per anotar els seus substrats no caracteritzats, es va provar PDPL afegint miniSOG a l'extrem N o C del parkin.Les cèl·lules es van tractar amb el transportador de protons de cianur de carbonil m-clorofenilhidrazona (CCCP) per activar la parkin mitjançant la via PINK1-Parkin.En comparació amb els nostres resultats BRD4 PDPL, la fusió del parkin N-terminal va revelar un conjunt més gran de proteïnes diana, tot i que va cobrir una part més gran del terminal C (177 de 210) (figura 5a, b i dades suplementàries 4).el resultat és coherent amb els informes que les etiquetes N-terminals poden activar Parkin44 de manera aberrant.Sorprenentment, només hi havia 18 proteïnes superposades a les nostres dades amb resultats AP-MS publicats per a Parkin43, probablement a causa de diferències entre les línies cel·lulars i els fluxos de treball de proteòmica.A més de quatre proteïnes conegudes (ARDM1, HSPA8, PSMD14 i PSMC3) identificades per dos mètodes (Fig. 5c)43.Per validar encara més els resultats de LC-MS/MS, es van utilitzar el tractament amb PDPL i el posterior Western blotting per comparar els resultats de l'assaig de cèl·lules mare HEK293T i la línia estable de parkin N-terminal.Els objectius anteriorment desconeguts CDK2, DUT, CTBP1 i PSMC4 es van provar amb un aglutinant conegut, DNAJB1 (Fig. 5d).
Trama volcànica de proteïnes que interaccionen amb la parkin a les cèl·lules HEK293T amb miniSOG expressat de manera estable fusionada a l'extrem N o C de la parkin (n = 3 experiments biològics independents).La prova t de Student de dues cues es va utilitzar en parcel·les de volcans.HEK293T es va utilitzar com a control negatiu. Les proteïnes que han canviat significativament es destaquen en vermell (p < 0, 05 i diferència d'intensitat d'ions > 2 vegades). Les proteïnes que han canviat significativament es destaquen en vermell (p < 0, 05 i diferència d'intensitat d'ions > 2 vegades). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интесни в интесно). Les proteïnes significativament alterades es destaquen en vermell (p < 0, 05 i diferència > 2 vegades en la intensitat dels ions).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 i > 2-кратная разница в исница в ионлной). Les proteïnes significativament alterades es destaquen en vermell (p < 0, 05 i > 2 vegades la diferència de força iònica).Les proteïnes relacionades importants per a HEK293T-miniSOG però no importants per a HEK293T es mostren en verd.b Diagrama de Venn que mostra proteïnes superposades entre construccions N-terminals i C-terminals.Les etiquetes N-terminals poden activar de manera aberrant la parkin i donar lloc a proteïnes més reconeixibles.c Diagrama de Venn que mostra proteïnes superposades entre PDPL i AP-MS.S'enumeren els interactors coneguts, inclosos 4 de les 18 proteïnes superposades i 11 de 159 proteïnes identificades específicament a PDPL.d Els objectius representatius identificats per LC-MS/MS es van verificar mitjançant Western blotting.Ssu72 i SNW1 es van identificar com a substrats de parkin no registrats.Aquests plasmidis proteics marcats amb FLAG es van transfectar a HEK293T i HEK293T-Parkin-miniSOG seguits del tractament amb CCCP en diversos moments.La degradació va ser més pronunciada a la línia de sobreexpressió de Parkin.f Utilitzant l'inhibidor del proteasoma MG132, es va confirmar que el procés de degradació de Ssu72 i SNW1 està mediat per la ubiquitinació del proteasoma.Aquests experiments es van repetir de manera independent almenys dues vegades amb resultats similars.Les dades en brut es proporcionen en forma de fitxers de dades en brut.
En particular, les proteïnes identificades per PDPL han d'incloure proteïnes d'unió a la parkina i els seus substrats.Per detectar substrats de parkin no registrats, vam seleccionar set proteïnes identificades (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 i SNW1) i plasmidis transfectats per exposar aquests gens a HEK293T normal i expressar de manera estable el HEK293T de miniSOG-Parkin seguit del tractament CCCP.Els nivells de proteïnes Ssu72 i SNW1 es van reduir significativament a la línia estable miniSOG-Parkin (Fig. 5e).El tractament amb CCCP durant 12 hores va donar lloc a la degradació més significativa d'ambdós substrats.Per investigar si la degradació de Ssu72 i SNW1 està regulada per la ubiquitinació del proteasoma, es va afegir l'inhibidor del proteasoma MG132 per inhibir l'activitat del proteasoma i, de fet, vam trobar que el seu procés de degradació estava inhibit (Fig. 5f).Es van confirmar objectius addicionals no substrats com a interactors de Parkin mitjançant Western blotting (figura suplementària 10), que va mostrar resultats consistents amb LC-MS/MS.En conclusió, la integració del flux de treball PDPL amb la verificació de transfecció de proteïnes diana permet la identificació de substrats de lligasa E3 no registrats.
Hem desenvolupat una plataforma comuna de marcatge de proximitat que permet identificar en l'espai i el temps els PDI interactius.La plataforma es basa en la proteïna fotosensibilitzadora miniSOG, que només té uns 12 kDa, menys de la meitat de la mida de l'enzim APEX2 madur (27 kDa) i un terç de la mida de TurboID (35 kDa).La mida més petita hauria d'ampliar molt el ventall d'aplicacions per estudiar els interactomes de proteïnes petites.Es necessita una exploració addicional de fotosensibilitzadors addicionals, ja siguin proteïnes codificades genèticament o molècules petites, per augmentar el rendiment quàntic d'oxigen singlet i ampliar la sensibilitat d'aquest enfocament.Per a la versió actual de miniSOG, es pot aconseguir una alta resolució temporal mitjançant la il·luminació blava per activar els marcadors de proximitat.A més, un temps d'exposició més llarg va alliberar un "núvol" més gran d'oxigen singlet, donant lloc a la modificació de residus d'histidina més distals, un augment del radi d'etiquetatge i la capacitat d'afinar la resolució espacial PDPL.També vam provar set sondes químiques per augmentar la relació senyal-fons i vam explorar el mecanisme molecular darrere d'aquest enfocament.El flux de treball TOP-ABPP combinat amb una cerca oberta imparcial va confirmar que les modificacions només es van produir a les histidines i no es va observar cap microambient consistent per a l'augment de les modificacions de la histidina, tret d'una preferència moderada per les histidines a la regió del bucle.
El PDPL també s'ha utilitzat per caracteritzar proteomes subcel·lulars amb una especificitat i una cobertura de proteoma almenys comparables a altres mètodes d'etiquetatge de proximitat i sondes químiques específiques d'orgànuls.Els marcadors de proximitat també s'han utilitzat amb èxit per caracteritzar els proteomes de superfície, lisosomals i associats al secretoma46,47.Creiem que el PDPL serà compatible amb aquests orgànuls subcel·lulars.A més, vam desafiar el PDPL identificant dianes per a la unió de proteïnes citosòliques que són més complexes que les proteïnes unides a la membrana a causa de les seves propietats dinàmiques i la participació en interaccions més temporals.El PDPL es va aplicar a dues proteïnes, el coactivador transcripcional BRD4 i la lligasa E3 Parkin associada a la malaltia.Aquestes dues proteïnes es van escollir no només per les seves funcions biològiques fonamentals, sinó també per la seva rellevància clínica i potencial terapèutic.Per a aquests dos PDI, es van identificar socis vinculants coneguts, així com objectius no registrats.En particular, la proteïna SFPQ associada a la separació de fases es va confirmar per co-IP, cosa que pot indicar un nou mecanisme pel qual BRD4 (isoforma curta) regula LLPS.Al mateix temps, creiem que la identificació de substrats de Parkin és un escenari en el qual es requereix la identificació d'adhesius indirectes.Vam identificar dos substrats de parkin no identificats i vam confirmar la seva degradació al llarg de la via d'ubiquitinació-proteasoma.Recentment, s'ha desenvolupat una estratègia de captura basada en mecanismes per detectar substrats d'hidrolasa atrapant-los amb enzims.Tot i que es tracta d'un mètode molt potent, no és adequat per a l'anàlisi de substrats implicats en la formació de grans complexos i requereix la formació d'enllaços covalents entre l'enzim i el substrat.Esperem que PDPL es pugui ampliar per estudiar altres complexos proteics i famílies d'enzims, com les famílies deubiquitinases i metaloproteases.
S'ha desenvolupat una nova forma de miniSOG, anomenada SOPP3, amb una producció millorada d'oxigen singlet.Vam comparar miniSOG amb SOPP3 i vam trobar un rendiment de marcatge millorat, tot i que la relació senyal-soroll es va mantenir sense canvis (figura suplementària 11).Vam plantejar la hipòtesi que l'optimització de SOPP3 (per exemple, mitjançant l'evolució dirigida) conduiria a proteïnes fotosensibilitzadores més eficients que requereixen temps de llum més curts i, per tant, permetrien capturar processos cel·lulars més dinàmics.En particular, la versió actual de PDPL es limita a l'entorn cel·lular, ja que requereix il·luminació de llum blava i no pot penetrar en els teixits profunds.Aquesta característica impedeix el seu ús en estudis de models animals.Tanmateix, la combinació d'optogenètica amb PDPL podria oferir una oportunitat per a la investigació en animals, especialment al cervell.A més, altres fotosensibilitzadors infrarojos dissenyats també eliminen aquesta limitació.Actualment s'està investigant en aquest àmbit.
La línia cel·lular HEK293T es va obtenir d'ATCC (CRL-3216).La línia cel·lular va resultar negativa per a la infecció per micoplasma i es va cultivar en DMEM (Thermo, # C11995500BT) complementat amb un 10% de sèrum fetal boví (FBS, Vistech, # SE100-B) i un 1% de penicil·lina / estreptomicina (Hyclone, # SV30010).crescut en.
Es van comprar 3-aminofenilè (mostra 3) i (4-etinilfenil) metanamina (mostra 4) a Bidepharm.La propilamina (sonda 2) es va comprar a Energy-chemicals.La N-(2-Aminofenil)pent-4-inamida (sonda 1) es va sintetitzar segons els mètodes publicats.
La taula suplementària 1 enumera les construccions genètiques utilitzades en aquest estudi.Les seqüències miniSOG i KillerRed es van clonar a partir d'un plasmidi regal de P. Zou (Universitat de Pequín).La seqüència d'orientació de la matriu mitocondrial es va derivar dels 23 aminoàcids N-terminals de COX4 i es va clonar als vectors indicats mitjançant un conjunt de Gibson (Beyotime, #D7010S).Per orientar la membrana i el nucli del reticle endoplasmàtic, l'ADN humà SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) amplificat per PCR d'una biblioteca d'ADNc de cèl·lules HEK293T i ADN H2B (donat per D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) i clonat, com s'ha esmentat anteriorment.Llevat que s'indiqui el contrari, altres gens de proteïnes utilitzats per a la transfecció i la construcció de línies cel·lulars estables es van amplificar per PCR a partir de la biblioteca d'ADNc de cèl·lules HEK293T.Es van utilitzar G3S (GGGS) i G4S (GGGGS) com a enllaços entre la proteïna de l'esquer i el miniSOG.Es va afegir una etiqueta d'epítop V5 (GKPIPNPLLGLDST) a aquestes construccions de fusió.Per a l'expressió en mamífers i per establir una línia cel·lular estable, la construcció de fusió miniSOG es va subclonar al vector lentiviral pLX304.Per a l'expressió bacteriana, es va clonar miniSOG al vector pET21a marcat 6xHis a l'extrem C-terminal.
Les cèl·lules HEK293T es van sembrar a 2,0 x 105 cèl·lules per pou en plaques de sis pous i es van transfectar 24 hores després amb plasmidis lentivirals recombinants (2,4 μg pLX304) i plasmidis d'envasament viral (1,5 μg psPAX2 i 1,2 μg pMD2. , #C0533), al voltant del 80% de fusió.Després de la transfecció durant la nit, el medi es va canviar i es va incubar durant 24 hores més.La recollida del virus es va dur a terme després de 24, 48 i 72 hores.Abans de la infecció de les línies cel·lulars diana, el medi viral es va filtrar a través d'un filtre de 0, 8 μm (Merck, #millex-GP) i es va afegir polibrene (Solarbio, #H8761) a una concentració de 8 μg/ml.Després de 24 hores, es va deixar que les cèl·lules es recuperessin canviant el medi.Les cèl·lules es van seleccionar mitjançant 5 μg/ml de blasticidina (Solarbio, #3513-03-9) per als tres primers passatges com a selecció més estricta.A continuació, s'utilitza 20 μg/ml com a règim més estricte per als tres passatges següents.
Les cèl·lules es van sembrar en cambres de 12 pous (Ibidi, #81201) a una densitat d'aproximadament 20.000 cèl·lules per pou.Per millorar l'adhesió de les cèl·lules HEK293T, afegiu 50 µg/ml de fibronectina (Corning, #356008) diluïda en solució salina tamponada amb fosfat (PBS, Sangon, #B640435) a 37 °C.Les cambres es van tractar prèviament durant 1 hora i després es van eliminar amb PBS.Després de 24 h, les cèl·lules es van rentar una vegada amb PBS, es van incubar amb la sonda 3 d'1 mM en una solució salina equilibrada de Hanks fresca (HBSS, Gibco, #14025092) durant 1 h a 37 ° C i després es van incubar amb un LED blau (460 nm). ).) es van irradiar durant 10 min a temperatura ambient.Després d'això, les cèl·lules es van rentar dues vegades amb PBS i es van fixar amb formaldehid al 4% en PBS (Sangon, #E672002) durant 15 minuts a temperatura ambient.L'excés de formaldehid es va eliminar de les cèl·lules fixes rentant-se tres vegades amb PBS.A continuació, es van permeabilitzar les cèl·lules amb Triton X-100 al 0, 5% (Sangon, #A600198) en PBS i es van rentar 3 vegades amb PBS.A continuació, traieu la cambra i afegiu a cada mostra 25 µl d'una barreja de reacció de clic que conté 50 µM de Cy3-azida (Aladdin, #C196720), 2 mM de CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM de BTTAA (Confluore, #BDJ-4) i 0,5 mg/ml d'ascorbat de sodi (Aladdin, núm. S105024) i s'incuba durant 30 minuts a temperatura ambient.Després d'una reacció ràpida, les cèl·lules es van rentar sis vegades amb PBS que contenia 0, 05% de Tween-20 (Sangon, # A600560) (PBST) i després es van bloquejar amb un 5% de BSA (Abcone, # B24726) en PBST durant 30 minuts a temperatura ambient.
Per a la immunotinció de colocalització, les cèl·lules es van incubar amb anticossos primaris d'acord amb les condicions indicades: mAb d'etiqueta anti-V5 de ratolí (1:500, CST, #80076), mAb de conill anti-Hsp60 (1:1000), ABclonal, #A0564), Anticòs anti-calnexina policlonal de conill (1:500, Abcam, #ab22595) o anticossos monoclonal anti-lamina A/C de conill (1:500; CST, #2032) a 4 °C durant la nit.Després de rentar-se 3 vegades amb PBST, les cèl·lules es van incubar amb anticossos secundaris: Alexa Fluor 488 anti-conill de cabra (Thermo, # A11034) diluït 1:1000, Alexa Fluor 594 anti-ratolí de cabra (CST, #8889) diluït 1:1000.dilució Diluir a temperatura ambient durant 30 minuts.Les cèl·lules es van rentar 3 vegades amb PBST i es van tacar amb DAPI (Thermo, #D1306) en PBS durant 10 minuts a temperatura ambient.Després de 3 rentats amb PBS, les cèl·lules es van segellar amb glicerol al 50% (Sangon, #A600232) en PBS per a la imatge.Les imatges immunofluorescents es van obtenir mitjançant un microscopi confocal ZEISS LSM 900 Airyscan2 i el programari ZNE 3.5.
Per a la imatge fluorescent d'oxigen singlet, les cèl·lules es van rentar dues vegades amb tampó Hanks HEPES abans d'afegir 100 nM Si-DMA al tampó Hanks HEPES (DOJINDO, # MT05).Després de l'exposició a la llum, les cèl·lules es van incubar en una incubadora de CO2 a 37 ° C durant 45 minuts.Les cèl·lules es van rentar dues vegades amb el tampó HEPES de Hanks i es van tacar amb Hoechst al tampó HEPES de Hanks durant 10 minuts a temperatura ambient i es van visualitzar amb un microscopi confocal ZEISS LSM 900., #M36008) en tampó HBSS que conté calci i magnesi.Després de l'exposició a la llum o a la doxorubicina (MCE, #HY-15142A), les cèl·lules es van incubar en una incubadora de CO2 a 37 °C durant 10 minuts, es van rentar dues vegades amb tampó HBSS i es van incubar amb Hoechst en tampó HBSS a temperatura ambient.minuts.La doxorubicina es va utilitzar com a control de sonda positiu on les cèl·lules es van tractar amb doxorubicina 20 μM en HBSS que contenia 1% de BSA durant 30 min.Les imatges immunofluorescents es van obtenir mitjançant un microscopi confocal Zeiss LSM 900.
Les cèl·lules HEK293T que expressaven de manera estable mito-miniSOG es van sembrar a una densitat d'aproximadament un 30% en plats de 15 cm.Després de 48 hores, quan es va assolir la confluència del ~ 80%, les cèl·lules es van rentar una vegada amb PBS, es van incubar amb 1 mM Probe 3 en tampó HBSS fresc durant 1 hora a 37 ° C i després es van il·luminar amb un LED blau durant 10 minuts a l'habitació. temperatura..Després, les cèl·lules es van rentar dues vegades amb PBS, es van raspar i es van tornar a suspendre en un tampó PBS fred amb gel que contenia inhibidors de la proteasa sense EDTA (MCE, #HY-K0011).Les cèl·lules es van lisar fent sonicar la punta durant 1 minut (1 segon encès i 1 segon apagat a un 35% d'amplitud).La barreja resultant es va centrifugar a 15.871 xg durant 10 min a 4 ° C per eliminar els residus i la concentració del sobrenedant es va ajustar a 4 mg/mL mitjançant un kit d'assaig de proteïnes BCA (Beyotime, # P0009).Combina 1 ml del lisat anterior amb azida de biotina fotodegradable 0,1 mM (Confluore, #BBBD-14), TCEP 1 mM (Sangon, #A600974), lligand TBTA 0,1 mM (Aladdin, #T162437) i incubadora de CuSO4 1 mM amb la part inferior. rotació durant 1 hora a temperatura ambient.Després d'una reacció ràpida, afegiu la barreja a la solució premesclada (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) en un vial de vidre de 10 ml.Les mostres es van barrejar i es van centrifugar a 4500 g durant 10 minuts a temperatura ambient.Les solucions inferior i superior es van descartar, el precipitat es va rentar dues vegades amb 1 ml de metanol i es va centrifugar a 15871 × g durant 5 min a 4 ° C.Afegiu 1 ml d'urea 8 M (Aladdin, núm. U111902) en bicarbonat d'amoni 25 mM (ABC, Aladdin, núm. A110539) per dissoldre el precipitat.Les mostres es van reconstituir amb ditiotreitol 10 mM (Sangon, # A100281 a 25 mM ABC) durant 40 minuts a 55 ° C seguits de l'addició de 15 mM de iodoacetamida fresca (Sangon, # A600539) a temperatura ambient a la foscor.Alquilació en 30 minuts..Es va afegir un ditiotreitol de 5 mM addicional per aturar la reacció.Prepareu aproximadament 100 µl de perles d'agarosa de NeutrAvidin (Thermo, #29202) per a cada mostra rentant-les 3 vegades amb 1 ml de PBS.La solució de proteoma anterior es va diluir amb 5 ml de PBS i es va incubar amb perles d'agarosa de NeutrAvidin prerentats durant 4 hores a temperatura ambient.A continuació, es van rentar les perles 3 vegades amb 5 ml de PBS que contenia 0, 2% de SDS (Sangon, # A600485), 3 vegades amb 5 ml de PBS que contenia 1 M d'urea i 3 vegades amb 5 ml de ddH2O.A continuació, es van recollir les perles per centrifugació i es van tornar a suspendre en 200 μl d'ABC 25 mM que contenia 1 M d'urea, 1 mM de CaCl 2 (Macklin, # C805228) i 20 ng / μl de tripsina (Promega, # V5280).Tripsinitzar durant la nit a 37 ° C amb rotació.La reacció es va aturar afegint àcid fòrmic (Thermo, # A117-50) fins que el pH va arribar a 2-3.Les perles es van rentar 3 vegades amb 1 ml de PBS que contenia 0, 2% de SDS, 3 vegades amb 1 ml de PBS que contenia 1 M d'urea i després 3 vegades amb 1 ml d'aigua destil·lada.Els pèptids modificats es van alliberar per lisi lleugera (365 nm) durant 90 min utilitzant 200 μl de MeOH al 70%.Després de la centrifugació, es va recollir el sobrenedant.A continuació, es van rentar les perles una vegada amb 100 μl de MeOH al 70% i es van agrupar els sobrenedants.Les mostres es van assecar en un concentrador de buit Speedvac i es van emmagatzemar a -20 ° C fins a l'anàlisi.
Per identificar i quantificar pèptids modificats amb oxigen singlet, les mostres es van redissoldre en àcid fòrmic al 0, 1% i es van analitzar 1 μg de pèptids mitjançant un espectròmetre de masses Orbitrap Fusion Lumos Tribrid equipat amb una font nano ESI de Tune i Xcalibur del programari del proveïdor 4.3.Les mostres es van separar en una columna capil·lar empaquetada internament de 75 µm × 15 cm amb material C18 de 3 µm (ReproSil-pur, # r13.b9.) i es van connectar a un sistema UHPLC EASY-nLC 1200 (Thermo).Els pèptids es van separar mitjançant cromatografia de gradient lineal de 95 minuts des del 8% de dissolvent B fins al 50% de dissolvent B (A = 0,1% d'àcid fòrmic en aigua, B = 0,1% d'àcid fòrmic en 80% d'acetonitril), després es van augmentar linealment fins al 98% de B min. en 6 min a un cabal de 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos recopila dades alternativament entre l'exploració MS completa i l'exploració MS2 en funció de les dades.La tensió de pulverització es va establir en 2, 1 kV i la temperatura del capil·lar de transport d'ions era de 320 ° C.Els espectres MS (350-2000 m/z) es van recollir amb una resolució de 120.000, AGC 4 × 105 i un temps d'entrada màxim de 150 ms.Els 10 precursors de càrrega múltiple més comuns en cada exploració completa es van fragmentar mitjançant HCD amb una energia de col·lisió normalitzada del 30%, una finestra d'aïllament de quadrupol d'1, 6 m/z i una configuració de resolució de 30.000.Un objectiu AGC per a espectrometria de masses en tàndem utilitzant 5 × 104 i temps d'entrada màxim de 150 ms.L'excepció dinàmica s'estableix en 30 segons. Els ions no assignats o els que tenien una càrrega d'1+ i >7+ van ser rebutjats per a MS/MS. Els ions no assignats o els que tenien una càrrega d'1+ i >7+ van ser rebutjats per a MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ i >7+ были отклонены для МС/МС. Els ions no assignats o els ions amb una càrrega d'1+ i >7+ es van rebutjar per a MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ i >7+ были отклонены для МС/МС. Els ions no especificats o els ions amb càrregues d'1+ i >7+ es van rebutjar per a MS/MS.
Les dades en brut es processen mitjançant la plataforma informàtica FragPipe basada en MSFragger.Els biaixos de massa i els aminoàcids corresponents es van determinar mitjançant un algorisme de cerca oberta amb una tolerància a la massa del precursor de -150 a 500 Da.A continuació, es van identificar pèptids modificats mitjançant modificacions d'histidina amb guanys de massa de +229,0964 i +247,1069 Da en PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Les cèl·lules que expressaven de manera estable el gen miniSOG fusionat es van xapar en plats de 6 cm.En arribar al ~80% de confluència, les cèl·lules es van rentar una vegada amb HBSS (Gibco, #14025092), després es van incubar amb sondes químiques en HBSS durant 1 hora a 37 ° C i es van il·luminar amb llum blava.LED de 10 W durant 20 minuts a temperatura ambient.Per determinar quin tipus d'espècie reactiva d'oxigen està implicada en PDPL, vitamina C 0,5 mM (MCE, #HY-B0166), Trolox 5 mM (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), Es van afegir manitol 100 mM (químic energètic, # 69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 a les cèl·lules com a suplements.Després de rentar-se amb PBS fred, les cèl·lules es van raspar, es van recollir en tubs de centrífuga d'1, 5 ml i es van sonicar amb una punta durant 1 min en 200 μl de PBS amb 1x inhibidor de proteasa sense EDTA (1 s i 1 s sense, amplitud 35%).La barreja resultant es va centrifugar a 15.871 × g durant 10 min a 4 ° C i la concentració del sobrenedant es va ajustar a 1 mg/mL mitjançant un kit d'assaig de proteïnes BCA.Aproximadament 50 µl del lisat anterior es van incubar amb azida de rodamina 0,1 mM (Aladdin, núm. T131368), TCEP 1 mM, lligand TBTA 0,1 mM i CuSO4 1 mM durant 1 hora a temperatura ambient amb rotació de baix a dalt.Després de la reacció de clic, es va dur a terme la precipitació amb acetona afegint 250 μl d'acetona prèviament refrigerada a les mostres, incubant a -20 ° C durant 20 min i centrifugant a 6010 × g durant 10 min a 4 ° C.Recollir el pellet i bullir en 50 µl de tampó de Laemmli 1x durant 10 min a 95 ° C.A continuació, es van analitzar les mostres en gels llargs SDS-PAGE i es van visualitzar mitjançant el sistema d'imatge Bio-rad ChemiDoc MP Touch amb el programari Image Lab Touch.
L'expressió i la purificació de la proteïna recombinant miniSOG-6xHis es va realitzar tal com es va descriure anteriorment.Breument, les cèl·lules E. coli BL21 (DE3) (TransGen, # CD701-02) es van transformar amb pET21a-miniSOG-6xHis i es va induir l'expressió de proteïnes amb IPTG 0, 5 mM (Sangon, # A600168).Després de la lisi cel·lular, les proteïnes es van purificar mitjançant perles d'agarosa Ni-NTA (MCE, núm. 70666), es van dialitzar contra PBS i es van emmagatzemar a -80 °C.
Per a un assaig de proximitat d'etiqueta in vitro basat en anticossos, barregeu 100 μM de miniSOG purificat, 1 mM de sonda 3 i 1 μg d'anticòs monoclonal de ratolí anti-etiqueta (TransGen, #HT501-01) en PBS fins a un volum de reacció total de 50 μl..La barreja de reacció es va irradiar amb llum LED blava durant 0, 2, 5, 10 i 20 min a temperatura ambient.La barreja es va incubar amb 0, 1 mM de biotina-PEG3-azida (Aladdin, # B122225), 1 mM de TCEP, 0, 1 mM de lligand TBTA i 1 mM de CuSO4 durant 1 h a temperatura ambient en un agitador de moviment ascendent.Després d'una reacció ràpida, afegiu 4x tampó de Laemmli directament a la barreja i bulliu a 95 ° C durant 10 min.Les mostres es van analitzar en gels SDS-PAGE i es van analitzar mitjançant western blotting amb estreptavidina-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Es va utilitzar un pèptid sintètic que conté histidina amb amidació C-terminal (LHDALDAK-CONH2) per analitzar l'etiquetatge in vitro basat en pèptids propers.En aquest assaig, es van barrejar 100 μM de miniSOG purificat, 10 mM de sonda 3 i 2 μg/ml de pèptid sintètic en PBS en un volum de reacció total de 50 μl.La mescla de reacció es va irradiar amb llum LED blava durant 1 hora a temperatura ambient.Es va analitzar un microlitre de mostra mitjançant un sistema LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight espectròmetre de masses amb programari d'anàlisi d'espectre MassLynx).
Les cèl·lules HEK293T que expressaven de manera estable el gen de fusió miniSOG es van sembrar en plats de 10 cm per a línies amb diferents localitzacions d'orgànuls (Mito, ER, Nucleus) i plats de 15 cm per a línies Parkin-miniSOG i BRD4-miniSOG.En arribar al ~ 90% de confluència, les cèl·lules es van rentar una vegada amb HBSS, després es van incubar amb la sonda 3 en HBSS durant 1 hora a 37 ° C i es van il·luminar amb un LED blau de 10 W a temperatura ambient.Per a l'etiquetatge sense contacte de Parkin, es va afegir 10 µM de portador de cianur de carbonil de protons m-clorofenilhidrazona CCCP (Solarbio, # C6700) amb la sonda 3 en HBSS durant 1 hora a 37 ° C.Els passos de lisi cel·lular, química de clic, reducció i alquilació eren els mateixos que es descriuen anteriorment, excepte que es van afegir 2 mg de lisat i es va utilitzar azida de biotina PEG3 en la reacció de clic en lloc de l'azida de biotina fotodegradable.Després de l'enriquiment, les perles es van rentar 3 vegades amb 5 ml de PBS que contenien 0, 2% de SDS, 3 vegades amb 5 ml de PBS que contenien 1 M d'urea i 3 vegades amb 5 ml de PBS.A continuació, es van afegir 2 µg de tripsina a 300 µl d'ABC 25 mM que contenien 1 M d'urea per tallar la proteïna durant la nit a 37 °C.La reacció es va aturar afegint àcid fòrmic fins que es va assolir un pH de 2-3.Després de la tripsinització a les perles, la solució de pèptids es va dessalar mitjançant una columna SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) i es va assecar en un concentrador de buit Speedvac.Els pèptids es van tornar a dissoldre en àcid fòrmic al 0, 1% i es van analitzar 500 ng de pèptids mitjançant un espectròmetre de masses Orbitrap Fusion Lumos Tribrid equipat amb la font nano-ESI descrita anteriorment.Els pèptids es van separar en precolumnes comercials RP-HPLC (75 μm x 2 cm) (Thermo, núm. 164946) i columnes analítiques RP-HPLC (75 μm x 25 cm) (Thermo, núm. 164941), ambdues plenes de 2 μm.gradient del 8% al 35% ACN en 60 minuts, després augmentat linealment fins al 98% B en 6 minuts a un cabal de 300 Nl/min.Els espectres MS (350-1500 m/z) es van recollir amb una resolució de 60.000, AGC 4 × 105 i un temps d'entrada màxim de 50 ms.Els ions seleccionats es van fragmentar seqüencialment per HCD en cicles de 3 s amb una energia de col·lisió normalitzada del 30%, una finestra d'aïllament quadrupol d'1,6 m/z i una resolució de 15000. Un objectiu AGC d'un espectròmetre de masses en tàndem de 5 × 104 i un temps d'injecció màxim. de 22 ms es van utilitzar.L'exclusió dinàmica s'estableix en 45 segons. Els ions no assignats o els que tenien una càrrega d'1+ i >7+ van ser rebutjats per a MS/MS. Els ions no assignats o els que tenien una càrrega d'1+ i >7+ van ser rebutjats per a MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ i >7+ были отклонены для МС/МС. Els ions no assignats o els ions amb una càrrega d'1+ i >7+ es van rebutjar per a MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ i >7+ были отклонены для МС/МС. Els ions no especificats o els ions amb càrregues d'1+ i >7+ es van rebutjar per a MS/MS.
Els passos de preparació de la mostra fins a l'enriquiment de les perles de NeutrAvidin van ser els mateixos que a l'anàlisi LC-MS/MS descrita anteriorment.Es van utilitzar aproximadament 50 μg de lisat com a entrada per al control de càrrega i es van utilitzar 2 mg de lisat per a les reaccions de clic.Després de l'enriquiment i el rentat amb neutravidina, les proteïnes lligades es van eluir afegint 50 μl de tampó de Laemmli a les perles de resina d'agarosa i bullint a 95 °C durant 5 minuts.L'entrada de càrrega de control i les mostres enriquides per comptes es van analitzar mitjançant SDS-PAGE i es van transferir a membranes PVDF (Millipore, #ISEQ00010) mitjançant mètodes estàndard de Western blot.Les membranes es van bloquejar amb llet desnatada al 5% (Sangon, #A600669) en TBS que contenia 0, 1% de tween-20 (TBST) i es van incubar seqüencialment amb anticossos primaris i secundaris.Els anticossos primaris es van diluir 1:1000 en llet desnatada al 5% en TBST i es van incubar durant la nit a 4 ° C.Els anticossos secundaris es van utilitzar en una proporció d'1:5000 i es van incubar durant 1 hora a temperatura ambient.Les membranes es van visualitzar per quimioluminescència mitjançant el sistema d'imatge Chemidoc MP.Totes les exploracions sense tallar de taques i gels de la figura es presenten com a dades en brut.
Els anticossos primaris utilitzats en aquest estudi van incloure anticossos monoclonals anti-SFPQ de conill (CST, núm. 71992), anticossos monoclonals anti-FUS de conill (CST, núm. 67840), anticossos policlonals de conill anti-NSUN2 (Proteintech, núm. 20854-1-). AP), anticòs policlonal anti-mSin3A de conill (Abcam, #ab3479), anticòs monoclonal anti-etiqueta de ratolí (TransGen, #HT201-02), anticòs monoclonal anti-β-actina de ratolí (TransGen, #HC201-01), anticòs monoclonal de conill - Anticòs monoclonal CDK2 (ABclonal, #A0094), anticòs monoclonal de conill contra CTBP1 (ABclonal, #A11600), anticòs policlonal de conill contra DUT (ABclonal, #A2901), anticòs policlonal de conill contra PSMC4 (ABclonal, #A2505), anticòs de conill. Anticòs policlonal DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Aquests anticossos es van utilitzar a una dilució 1:1000 en llet desnatada al 5% en TBST.Els anticossos secundaris utilitzats en aquest estudi van incloure IgG anti-conill (TransGen, # HS101-01), IgG anti-ratolí (TransGen, # HS201-01) a una dilució 1:5000.
Per investigar més si BRD4 interacciona amb SFPQ, es van xapar cèl·lules estables HEK293T i BRD4-miniSOG que sobreexpressen HEK293T en plats de 10 cm.Les cèl·lules es van rentar amb PBS fred i es van lisar en 1 ml de tampó de lisi Pierce IP (Thermo Fisher, #87787) amb inhibidor de proteasa sense EDTA durant 30 minuts a 4 °C.Després d'això, els lisats es van recollir en tubs de centrífuga d'1, 5 ml i es van centrifugar a 15.871 xg durant 10 min a 4 ° C.El sobrenedant es va recollir i es va incubar amb 5 µg d'anticòs monoclonal de ratolí marcat amb anti-V5 (CST, #80076) durant la nit a 4 °C.Rentar aproximadament 50 µl de perles magnètiques de proteïna A/G (MCE, #HY-K0202) dues vegades amb PBS que conté un 0,5% de Tween-20.A continuació, els lisats cel·lulars es van incubar amb perles magnètiques durant 4 hores a 4 ° C amb rotació de baix a dalt.A continuació, es van rentar les perles quatre vegades amb 1 ml de tampó PBST i es van bullir a 95 ° C durant 5 min.Les mostres es van analitzar en gels SDS-PAGE i es van transferir a membranes de PVDF mitjançant mètodes de Western blot estàndard.Les membranes es van bloquejar en llet desnatada al 5% en TBST i es van incubar seqüencialment amb anticossos primaris i secundaris.L'anticòs monoclonal anti-SFPQ de conill primari (CST, #71992) es va utilitzar en una proporció d'1:1000 en llet desnatada al 5% en TBST i es va incubar durant la nit a 4 °C.Es va utilitzar IgG anti-conill en una proporció d'1:5000 i es va incubar durant 1 hora a temperatura ambient.Les membranes es van visualitzar per quimioluminescència mitjançant el sistema d'imatge Chemidoc MP.
Totes les estructures utilitzades per a l'anàlisi de l'àrea de superfície accessible amb dissolvents (SASA) es van obtenir del Protein Data Bank (PDB)52 o la base de dades AlphaFold Protein Structure Database53.El SASA absolut es va calcular per a cada residu mitjançant el programa FreeSASA.Només es van utilitzar dades SASA completes i inequívoques per a la histidina marcada i els seus veïns per obtenir la SASA mitjana per a cada estructura.L'accessibilitat relativa al dissolvent (RSA) per a cada histidina es va calcular dividint el valor SASA absolut per la superfície màxima empírica de residus possible disponible per al dissolvent.Totes les histidines es van classificar llavors com a amagades si la RSA mitjana era inferior al 20%, en cas contrari exposades56.
Els fitxers en brut obtinguts en mode DDA es van cercar mitjançant Proteome Discoverer (v2.5) o MSfragger (Fragpipe v15.0) a la base de dades de proteïnes verificada de SwissProt adequada que contenia contaminants comuns.Els pèptids requerien tripsina completa amb dos llocs d'escissió que falten, la metilació de carbamoil com a modificació fixa i l'oxidació de la metionina com a modificació dinàmica.Les toleràncies de pes del precursor i del fragment es van establir a 10 ppm i 0, 02 Da (MS2 Orbitrap), respectivament. Es van eliminar els cops de contaminants i es van filtrar les proteïnes per obtenir una taxa de descobriment fals <1%. Es van eliminar els cops de contaminants i es van filtrar les proteïnes per obtenir una taxa de descobriment fals <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы полунфи 1%. Es van eliminar els impactes contaminants i es van filtrar les proteïnes per donar una taxa de detecció falsa <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижеств были удалены, а белки отфильтрованы для достижеств были удалены %1. Es van eliminar els impactes contaminants i es van filtrar les proteïnes per aconseguir una taxa de falsos positius <1%.Per a l'anàlisi quantitativa sense l'ús d'etiquetes, es va utilitzar el contingut de proteïna normalitzat de tres repeticions biològiques.L'anàlisi de localització subcel·lular de proteïnes es va realitzar mitjançant l'anàlisi de Gene Ontology (GO) de DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 i bases de dades compilades i publicades pel grup Alice Ting.El mapa volcànic es va obtenir de Perseu (v1.6.15.0). Els canvis de plec de l'abundància de proteïnes es van provar per a la significació estadística mitjançant una prova t de dues cares i es van identificar els cops de proteïna amb un canvi d'abundància > 2 (tret que s'indiqui el contrari) i un valor p <0, 05. Els canvis de plec de l'abundància de proteïnes es van provar per a la significació estadística mitjançant una prova t de dues cares i es van identificar els cops de proteïna amb un canvi d'abundància > 2 (tret que s'indiqui el contrari) i un valor p <0, 05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Els canvis de plec de contingut de proteïnes es van provar per a la significació estadística mitjançant una prova t de dues cues i es van identificar les coincidències de proteïnes amb un canvi de contingut> 2 (tret que s'indiqui el contrari) i un valor ap <0, 05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （除非 另 有））） 和 P 值 <0,05。使用 双边 T 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 说明）） 和 P 值 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. La significació estadística dels canvis de plec en el contingut de proteïnes es va provar mitjançant una prova t de dues cues i es van determinar les coincidències de proteïnes per a canvis de contingut > 2 (tret que s'indiqui el contrari) i valors p <0, 05.L'anàlisi de la interacció de proteïnes es va realitzar mitjançant l'anàlisi GO juntament amb la base de dades String.
Es van realitzar tres rèpliques biològiques amb resultats similars.L'anàlisi estadística es va fer amb GraphPad Prism (programari GraphPad) i es van generar diagrames de volcans amb Perseus (v1.6.15.0).Per comparar els dos grups, es van determinar els valors p mitjançant una prova t de Student de dues cues.Només es van incloure proteïnes singleton identificades almenys dues vegades al grup experimental a les parcel·les del volcà, i els valors que falten corresponents al grup control es van substituir per Perseus d'una distribució normal perquè es pogués calcular el valor p.Les barres d'error representen la mitjana ± desviació estàndard.En les anàlisis proteòmiques per a l'anàlisi estadística, es va retenir l'abundància de proteïnes que van aparèixer en almenys dues rèpliques biològiques.No es van utilitzar mètodes estadístics per predeterminar la mida de la mostra.Els experiments no són aleatoris.Els investigadors no estaven cecs a les tasques durant l'experiment i l'avaluació dels resultats.
Per obtenir més informació sobre el disseny de l'estudi, consulteu el resum de l'Informe de recerca sobre la natura enllaçat a aquest article.
Les dades d'espectrometria de masses obtingudes en aquest estudi es van enviar al ProteomeXchange Consortium mitjançant el dipòsit de socis iProX57 amb l'ID del conjunt de dades PXD034811 (conjunt de dades PDPL-MS).Les dades en brut es proporcionen en forma de fitxers de dades en brut.Aquest article proporciona les dades originals.
Gingras, AC, Abe, KT i Raught, B. Conèixer el barri: ús de la biotinilació dependent de la proximitat per caracteritzar complexos proteics i cartografiar orgànuls. Gingras, AC, Abe, KT i Raught, B. Conèixer el barri: ús de la biotinilació dependent de la proximitat per caracteritzar complexos proteics i cartografiar orgànuls.Gingras, AS, Abe, KT i Raut, B. Familiaritat amb l'entorn: utilitzant la biotinilació dependent de la proximitat per caracteritzar complexos proteics i mapejar orgànuls. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT i Raught, B. Comprendre el barri: utilitzar la dependència del barri de la vida biològica.Gingras, AS, Abe, KT i Raut, B. Comprensió de la proximitat: caracterització de complexos proteics i mapeig d'orgànuls mitjançant la biotinilació dependent de la proximitat.Actual.La meva opinió.Química.biologia 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Mapejar el microentorn transferint l'energia de Dexter a les cèl·lules immunitàries.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Les xarxes d'escala de dos proteomes detecten la remodelació específica de la cèl·lula de l'interatoma humà.Cel·les 184, 3022–3040.e3028 (2021).
Hora de publicació: 15-set-2022
