Les estratègies de diagnòstic tradicionals per detectar malalties infeccioses requereixen l'ús d'instruments de sobretaula que no són adequats per a les proves al punt de cura (POCT).La microfluídica emergent és una tecnologia altament miniaturitzada, automatitzada i integrada que és una alternativa potencial als mètodes tradicionals per a un diagnòstic in situ ràpid, de baix cost i precís.Els mètodes de diagnòstic molecular s'utilitzen àmpliament en dispositius microfluídics com els mètodes més efectius per a la detecció de patògens.Aquesta revisió resumeix els avenços recents en el diagnòstic molecular basat en microfluídics de malalties infeccioses tant des d'una perspectiva acadèmica com industrial.En primer lloc, descrivim un processament típic en xip d'àcids nucleics, inclòs el pretractament de la mostra, l'amplificació i la lectura del senyal.A continuació, es comparen les característiques, avantatges i inconvenients dels quatre tipus de plataformes microfluídiques.A continuació, parlarem de l'ús d'assajos digitals per a la quantificació absoluta d'àcids nucleics.Els dispositius de diagnòstic molecular basats en microfluídics, clàssics i comercials recents, es resumeixen com a evidència de l'estat actual del mercat.Finalment, proposem direccions futures per al diagnòstic microfluídic de malalties infeccioses.
Les malalties infeccioses són causades per patògens, inclosos bacteris, virus i paràsits, que es distribueixen per tot el món.A diferència d'altres malalties, els patògens s'infecten ràpidament i es propaguen entre els humans i els animals hostes mitjançant la inoculació, l'aire i els medis d'aigua [1].La prevenció de malalties infeccioses és fonamental com a mesura de salut pública.Tres estratègies principals per combatre les malalties infeccioses: (1) controlar la font d'infecció;(2) interrupció del camí de transmissió;(3) protecció de poblacions susceptibles.Entre les principals estratègies, el control de la font d'infecció es considera l'estratègia més important per la seva comoditat i baix cost.El diagnòstic ràpid, l'aïllament i el tractament de les persones infectades són crítics, i requereixen estratègies de diagnòstic ràpides, sensibles i precises [2].El diagnòstic actual de malalties infeccioses sol combinar l'examen clínic basat en signes i símptomes i estudis de laboratori com el cultiu cel·lular i el diagnòstic molecular, que requereixen personal format, procediments intensius de mà d'obra i equips de proves cars [3, 4].La prevenció dels brots de malalties infeccioses requereix un diagnòstic local ràpid, econòmic i precís, especialment a les zones amb recursos limitats on les malalties infeccioses són comunes i greus [5], així com un tractament a la natura o al camp de batalla, on les emergències són imprevisibles..l'atenció mèdica és limitada [6].En aquest context, la microfluídica és una tecnologia que combina tecnologies de sistemes microelectromecànics, nanotecnologia o ciència dels materials per a la manipulació precisa de fluids [7,8,9,10], proporcionant noves possibilitats per a la detecció al punt de cura (POCT).) agents infecciosos fora dels hospitals i laboratoris.En comparació amb els diagnòstics tradicionals que requereixen temps, la tecnologia microfluídica ofereix mostres i estalvis de costos per al diagnòstic molecular durant els brots de malalties.La propagació global de la malaltia coronavirus 2019 (COVID-19) és causada pel coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la síndrome respiratòria aguda severa, de manera que es torna a emfatitzar la importància de la microfluídica per a la prevenció i el control oportuns de la pandèmia [11, 12]. , 13].A diferència dels diagnòstics tradicionals, el POCT microfluídic utilitza petits dispositius portàtils que van des d'analitzadors de banc fins a petites tires de prova laterals per provar a prop del punt de mostreig [14].Aquestes proves inclouen una preparació de mostres simplista o no, una amplificació ràpida del senyal i lectures sensibles del senyal que donen com a resultat una durada curta i resultats precisos en qüestió de minuts.La disponibilitat i la producció massiva d'instruments sanitaris basats en microfluídics han ampliat les seves aplicacions de diagnòstic directes i rendibles fora de l'hospital, a prop del pacient i fins i tot a casa.
Entre les estratègies existents per diagnosticar malalties infeccioses, el diagnòstic molecular és una de les més sensibles [15, 16].A més, el diagnòstic molecular s'utilitza sovint com a estàndard d'or per a la detecció contínua de COVID-19, permetent la detecció directa de regions específiques d'ARN o ADN del virus abans de l'inici d'una resposta immune [17, 18].En la revisió actual, presentem els últims avenços en processos de diagnòstic molecular basats en microfluídica per a malalties infeccioses, des d'una perspectiva acadèmica fins a perspectives industrials futures (Fig. 1).Començarem amb tres passos clau en la detecció d'àcids nucleics: pretractament de mostres en xip, amplificació d'àcids nucleics i lectura del senyal.Després vam comparar diferents tipus de plataformes microfluídiques amb la seva estructura i funció, mostrant característiques úniques (forts i debilitats).La detecció digital d'àcids nucleics es discuteix més i es posa com a exemple d'una tecnologia de tercera generació per a la quantificació absoluta de molècules de patògens infecciosos.A més, es presentaran diversos dispositius POCT comercials típics i més recents per demostrar l'estat actual del mercat POCT microfluídic per al diagnòstic molecular.També parlarem i explicarem la nostra visió per a futures aplicacions.
Els mòduls de xips microfluídics per a la detecció d'àcids nucleics es poden dividir en tres categories (mostreig, reconeixement i senyalització) segons les seves funcions [19].Entre aquests mòduls, el mòdul de mostreig realitza principalment la lisi de mostres i l'extracció d'àcids nucleics.El mòdul sensor controla principalment la conversió i l'amplificació dels senyals d'àcid nucleic.El mòdul de senyalització detecta el senyal convertit i processat pel mòdul de detecció.A partir del procés de detecció d'àcids nucleics en un xip, resumirem els diferents xips que poden realitzar la funció "d'entrada i sortida".
El primer pas en la detecció d'àcid nucleic és l'extracció d'àcid nucleic, és a dir, aïllar l'àcid nucleic diana de la mostra original.L'extracció d'àcid nucleic es realitza per purificar els àcids nucleics d'altres contaminants moleculars, garantir la integritat de l'estructura primària de les molècules d'àcid nucleic i optimitzar els resultats.L'extracció d'àcids nucleics requereix la lisi de la mostra necessària i la captura d'àcids nucleics, la qualitat i l'eficiència de les quals tenen un gran impacte en els resultats de la investigació i el diagnòstic.Qualsevol efecte secundari subtil durant l'extracció pot limitar la detecció addicional.Per exemple, els mètodes de reacció en cadena de la polimerasa (PCR) i d'amplificació isotèrmica de bucle (LAMP) són inhibits per alguns dissolvents orgànics residuals com l'etanol i l'isopropanol en reactius d'aïllament d'àcids nucleics [20].L'extracció líquid-líquid i l'extracció en fase sòlida són els mètodes més populars per aïllar els àcids nucleics [21], tanmateix, l'extracció líquid-líquid en un xip és extremadament limitada, ja que els reactius utilitzats en l'extracció líquid-líquid causen corrosió de la majoria de xips microfluídics. .Aquí, destaquem els mètodes d'extracció en fase sòlida basats en microarrays i comparem els seus avantatges i desavantatges.
El silici és un material de substrat compatible amb els àcids nucleics per la seva biocompatibilitat, estabilitat i facilitat de modificació [22].És important destacar que, quan es modifica amb sílice o altres materials, aquest compost presenta propietats per adsorbir àcids nucleics carregats negativament en condicions de pH baix i sal, mentre elueix amb solucions de pH alt i baix.A partir d'aquest fenomen, és possible purificar l'àcid nucleic.
S'han utilitzat diverses formes de materials basats en sílice per a l'extracció d'àcids nucleics en microfluídica, com ara perles de sílice, pols, filtres de microfibra i membranes de sílice [23, 24, 25, 26].Depenent de les propietats del material, els materials a base de silici es poden utilitzar en microcircuits de diferents maneres.Per exemple, els grànuls de sílice, les pols i els nanofiltres comercials es poden col·locar simplement als porus o microcanals dels xips microfluídics i ajudar a extreure els àcids nucleics de les mostres [27, 28, 29].Les membranes de sílice modificades a la superfície també es poden utilitzar per purificar ràpidament l'ADN dels patògens a baix cost.Per exemple, Wang et al.[30] Combinant reaccions d'amplificació desnaturalitzant amb intercanvi de cadena mediat per vesícules amb membranes de sílice recobertes d'oligosacàrids de quitosà, es va introduir un sistema portàtil versàtil que va detectar amb èxit entre 102 i 108 unitats formadores de colònies.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., i la presència del virus era fàcilment visible.Powell et al.[31] Aleshores es van utilitzar microarrays basats en silici per detectar el virus de l'hepatitis C (VHC), el virus de la immunodeficiència humana (VIH), el virus del Zika i el virus del papil·loma humà i la propagació automàtica, en la qual es va desenvolupar un microreactor tortuós d'1,3 μl per capturar virus d'ARN.i realitzar una amplificació in situ.A més d'aquests mètodes, les microcolumnes de sílice modificades a la superfície també tenen un paper clau en l'extracció d'àcids nucleics, ja que la geometria i les propietats del material modificador augmenten molt l'eficiència de l'extracció.Chen et al.[32] va proposar una plataforma microfluídica per aïllar l'ARN de baixa concentració basada en microcolumnes de silici recobertes d'amino.Aquest dispositiu microfluídic integra una matriu de micropilars de 0,25 cm2 sobre un substrat de silici per aconseguir una major eficiència d'extracció a través d'un disseny d'alta superfície a volum.L'avantatge d'aquest disseny és que el dispositiu microfluídic pot aconseguir fins a un 95% d'eficiència d'extracció d'àcids nucleics.Aquestes estratègies basades en silici demostren el valor d'aïllar ràpidament els àcids nucleics a baix cost.En combinació amb xips microfluídics, les estratègies d'extracció basades en silici no només poden augmentar l'eficiència de la detecció d'àcids nucleics, sinó que també poden facilitar la miniaturització i la integració de dispositius analítics [20].
Els mètodes de separació magnètica utilitzen partícules magnètiques per aïllar els àcids nucleics en presència d'un camp magnètic extern.Les partícules magnètiques d'ús habitual inclouen partícules magnètiques Fe3O4 o γ-Fe2O3 recobertes de sílice, amino i carboxil [33,34,35,36].La característica distintiva de les partícules magnètiques en comparació amb els mètodes SPE basats en silici és la facilitat de manipulació i control amb imants externs.
Utilitzant la interacció electrostàtica entre els àcids nucleics i la sílice, en condicions de sal elevat i pH baix, els àcids nucleics s'adsorbeixen a la superfície de les partícules magnètiques recobertes de sílice, mentre que en condicions de sal baixa i pH alt, les molècules es poden rentar. de nou..Les perles magnètiques recobertes de sílice permeten extreure ADN de mostres de gran volum (400 μL) mitjançant un moviment controlat magnèticament [37].Com a demostració, Rodríguez-Mateos et al.[38] utilitzaven imants ajustables per controlar la transferència de perles magnètiques a diferents cambres.A partir de partícules magnètiques recobertes de sílice, es poden extreure 470 còpies/ml d'ARN genòmic SARS-CoV-2 de mostres d'aigües residuals per a la detecció de transcripció inversa LAMP (RT-LAMP) i la resposta es pot llegir en 1 hora.a ull nu (Fig. 2a).
Dispositius basats en materials magnètics i porosos.Diagrama conceptual del dispositiu microfluídic IFAST RT-LAMP per a la detecció d'ARN SARS-CoV-2 (adaptat de [38]).b Microdispositiu centrífug per a dSPE d'àcid nucleic amb hisop bucal (adaptat de [39]).c Concentrador de mostres autoalimentat integrat mitjançant una targeta FTA® (adaptat de [50]).d Paper de filtre Fusion 5 modificat amb quitosà (adaptat de [51]).SARS-CoV-2 síndrome respiratòria aguda severa coronavirus 2, amplificació isotèrmica mediada per bucle de transcripció inversa RT-LAMP, socis tecnològics de cercadors de FTA, àcid nucleic NA
Les partícules magnètiques carregades positivament són ideals per unir la columna vertebral de fosfat d'un àcid nucleic.A una certa concentració de sal, els grups fosfat d'àcids nucleics carregats negativament es poden carregar positivament a la superfície de les partícules compostes magnètiques.Per tant, es van desenvolupar nanopartícules magnètiques amb una superfície rugosa i una alta densitat de grups amino per a l'extracció d'àcids nucleics.Després de la separació i el bloqueig magnètics, les nanopartícules magnètiques i els complexos d'ADN es poden utilitzar directament en PCR, la qual cosa elimina la necessitat d'operacions de purificació i elució complexes i que requereixen temps [35].Les nanopartícules magnètiques recobertes amb grups carboxil negatius també s'han utilitzat per separar àcids nucleics adsorbits a superfícies en solucions de polietilenglicol i clorur sòdic d'alta concentració [36].Amb aquestes perles magnètiques modificades a la superfície, l'extracció d'ADN és compatible amb l'amplificació posterior.Dignan et al.[39] va descriure una plataforma microfluídica centrífuga automatitzada i portàtil per al pretractament d'àcids nucleics, que permetia al personal no tècnic utilitzar-la al lloc.A més, la compatibilitat de l'ADN aïllat amb LAMP, un mètode molt adequat per a l'anàlisi d'àcids nucleics al punt de cura, demostra encara més els requisits mínims d'equip i la idoneïtat per a assajos colorimètrics (Fig. 2b).
Els mètodes de perles magnètiques ofereixen la possibilitat d'extracció automatitzada, algunes de les quals existeixen en extractors d'àcid nucleic automatitzats comercials [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, EUA), QIAcube® HT;CapitalBio (Beijing, Xina) i Biomek®;Beckman (Miami, EUA).), Florida, EUA)].Els avantatges de combinar perles magnètiques amb microfluídica es poden utilitzar per a l'extracció automàtica eficient d'àcids nucleics, que podria avançar en el desenvolupament del diagnòstic molecular;tanmateix, la combinació de perles magnètiques amb microfluídica encara depèn en gran mesura de sistemes de control complexos per a la manipulació precisa de les perles magnètiques, la qual cosa explica que la popularitat dels productes comercials siguin voluminosos i cars, cosa que limita l'aplicació posterior de les perles magnètiques en POCT.
També s'han utilitzat diversos materials porosos com ara filtres de nitrocel·lulosa modificats, targetes Finders Technology Associates (FTA), papers de filtre a base de polietersulfona i materials recoberts de glicà per a la detecció d'àcids nucleics [40, 41, 42, 43, 44].Els materials fibrosos porosos com el paper fibrós es van utilitzar per primera vegada per aïllar l'ADN entrellaçant físicament molècules d'ADN de cadena llarga amb fibres.Els porus petits condueixen a una forta restricció física de les molècules d'ADN, que afecta positivament l'extracció d'ADN.A causa de les diferents mides de porus del paper fibrós, l'eficiència d'extracció no pot satisfer les necessitats d'amplificació de l'ADN [45, 46].La targeta FTA és un paper de filtre comercial utilitzat en el camp de la medicina forense i àmpliament utilitzat en altres àrees del diagnòstic molecular.Mitjançant l'ús de paper de filtre de cel·lulosa impregnat amb diversos productes químics per lisar les membranes cel·lulars de la mostra, l'ADN alliberat està protegit de la degradació fins a 2 anys.Més recentment, s'ha desenvolupat paper de cel·lulosa impregnat per a la detecció molecular de diversos patògens, inclosos el SARS-CoV-2, la leishmaniosi i la malària [47,48,49].El VIH al plasma aïllat es lisa directament i l'àcid nucleic viral s'enriqueix a la membrana de flux FTA® integrada al concentrador, que permet una producció eficient de l'àcid nucleic [50] (Fig. 2c).El principal problema amb la detecció d'àcids nucleics mitjançant targetes FTA és que productes químics com la guanidina i l'isopropanol inhibeixen les reaccions d'amplificació posteriors.Per resoldre aquest problema, hem desenvolupat un paper de filtre modificat amb quitosà Fusion 5, que combina els avantatges tant de l'entrellaçat físic de molècules d'ADN com de paper de filtre fibrós, com de l'adsorció electrostàtica de l'ADN en compostos modificats amb quitosà per aconseguir una extracció d'àcid nucleic altament eficient. ..fibres de filtre [51] (Fig. 2d).De la mateixa manera, Zhu et al.[52] va demostrar un mètode de PCR modificat amb quitosà basat en un sistema microfluídic capil·lar in situ per a un aïllament i detecció ràpids de l'ARN del virus Zika.Els àcids nucleics es poden adsorbir/desorbir en un medi mixt de lisat/PCR, respectivament, segons la propietat de l'interruptor d'encesa/desactivació del quitosà.encès i apagat”, responent al pH.
Com s'ha esmentat anteriorment, aquestes estratègies combinen els avantatges de diversos materials en fase sòlida i augmenten l'eficiència de l'extracció d'àcids nucleics en microfluídica.En aplicacions pràctiques, l'ús d'aquests materials en grans quantitats no és econòmic, i el tractament superficial adequat o la modificació superficial dels materials comuns amb aquests materials també poden preservar la seva funció.Per tant, es creu que la implementació d'aquestes estratègies després d'un estudi pilot pot reduir costos.
Les proves d'àcid nucleic en plataformes microfluídiques sovint utilitzen volums de mostra petits (< 100 µl), per tant requereixen l'amplificació dels àcids nucleics diana amb sondes específiques per convertir-les en un senyal convenient per a la detecció aigües avall (òptica, elèctrica i magnètica) [53, 54]. Les proves d'àcid nucleic en plataformes microfluídiques sovint utilitzen volums de mostra petits (< 100 µl), per tant requereixen l'amplificació dels àcids nucleics diana amb sondes específiques per convertir-les en un senyal convenient per a la detecció aigües avall (òptica, elèctrica i magnètica) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. En provar àcids nucleics en plataformes microfluídiques, sovint s'utilitzen petits volums de mostra (<100 µL), de manera que es requereix l'amplificació d'àcids nucleics diana amb sondes especials per convertir-lo en un senyal convenient per a la detecció posterior (òptica, elèctrica i magnètica). [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 （<100 µl اt ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 特定 探针 扩增 目标 ， ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学）） 信号 [53, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. La detecció d'àcids nucleics en plataformes microfluídiques sol utilitzar petits volums de mostra (<100 μl), que requereix l'amplificació dels àcids nucleics diana amb sondes especials per convertir-los en senyals per a la detecció posterior (òptica, elèctrica i magnètica) [53, 54]] .L'amplificació d'àcids nucleics en microfluídica també pot accelerar les reaccions, optimitzar els límits de detecció, reduir els requisits de mostres i millorar la precisió de la detecció [55, 56].En els últims anys, amb la realització d'una detecció ràpida i precisa, s'han aplicat diversos mètodes d'amplificació d'àcids nucleics en microfluídica, inclosa la PCR i algunes reaccions d'amplificació isotèrmica.Aquesta secció resumirà els mètodes per a la detecció d'àcids nucleics basats en sistemes microfluídics.
La PCR és una simulació del procés de replicació de l'ADN d'un organisme, la teoria del qual es descriu amb detall en altres llocs i no es discutirà aquí.La PCR pot amplificar una quantitat molt petita d'ADN/ARN objectiu a una velocitat exponencial, fent de la PCR una eina poderosa per a la detecció ràpida d'àcids nucleics.En les últimes dècades, s'han desenvolupat molts dispositius microfluídics portàtils equipats amb sistemes de ciclisme tèrmic de PCR per satisfer les necessitats de diagnòstic al punt d'atenció [57, 58].La PCR en xip es pot dividir en quatre tipus (PCR convencional, de flux continu, commutada espacialment i convectiva) segons diferents mètodes de control de temperatura [59].Per exemple, Gee et al.[60] van desenvolupar un mètode de PCR quantitativa de transcripció inversa directa (RT-qPCR) a la seva pròpia plataforma microfluídica per a la detecció múltiple de virus SARS-CoV-2, grip A i B en mostres de hisop de gola (Fig. 3a).Park et al.[61] va construir un xip d'anàlisi de patògens senzill integrant PCR de pel·lícula fina, elèctrodes i un mòdul microfluídic basat en polidimetilsiloxà accionat amb els dits.Tanmateix, ambdues obres encarnen les deficiències comunes de la PCR convencional.La PCR requereix un cicle tèrmic, que limita la miniaturització del dispositiu i el temps de prova reduït.
El desenvolupament de PCR microfluídica i de commutació espacial basada en flux continu és fonamental per abordar aquest problema.Utilitzant un canal serpentí llarg o un canal recte curt, la PCR de flux continu pot proporcionar una amplificació ràpida fent circular activament reactius en tres zones de preescalfament amb una bomba fora de xip.Aquesta operació evita amb èxit la fase de transició entre diferents temperatures de reacció i, per tant, redueix significativament el temps de prova [62] (Fig. 3b).En un altre estudi de Jung et al.[63] va proposar un nou analitzador genètic de PCR rotatiu que combina les característiques de la PCR fixa i de flux per a la PCR de transcripció inversa ultraràpida i múltiple (Fig. 3c).Per a l'amplificació d'àcids nucleics, el microxip de PCR es girarà a través de tres blocs d'escalfament a diferents temperatures: 1. Bloc de desnaturalització 94°C, 2. Bloc de recuit a 58°C, 3. Bloc d'expansió a 72°C.
Aplicació de la PCR en microfluídica.Representació esquemàtica de dirRT-qPCR en una plataforma microfluídica (adaptat de [60]).b Representació esquemàtica d'un microarray de PCR de flux continu basat en un canal serpentí (adaptat de [62]).c Representació esquemàtica d'un analitzador genètic de PCR rotatiu, format per un microxip, tres blocs de calefacció i un motor pas a pas (adaptat de [63]).d Diagrama de PCR de termoconvecció amb centrifugació i configuració (adaptat de [64]).DirRT-qPCR, reacció en cadena de la polimerasa de transcripció inversa quantitativa directa
Utilitzant capil·lars i bucles o fins i tot plaques primes, la PCR de convecció pot amplificar ràpidament els àcids nucleics mitjançant convecció tèrmica lliure natural sense necessitat d'una bomba externa.Per exemple, es va desenvolupar una plataforma microfluídica de polímer d'olefina cíclica en una etapa de calefacció rotativa fabricada que utilitza un cicle tèrmic amb centrifugació en un microcanal de bucle de PCR [64] (Fig. 3d).La solució de reacció és impulsada per convecció tèrmica, que intercanvia contínuament alta i baixa temperatura en un microcanal amb una estructura anular.Tot el procés d'amplificació es pot completar en 10 minuts amb un límit de detecció de 70,5 pg/canal.
Com era d'esperar, la PCR ràpida és una eina poderosa per a sistemes de diagnòstic molecular i d'anàlisi múltiple de resposta de mostra totalment integrats.La PCR ràpida redueix significativament el temps necessari per detectar el SARS-CoV-2, la qual cosa contribueix al control efectiu de la pandèmia de la COVID-19.
La PCR requereix un termociclador complex que no és adequat per a POCT.Més recentment, s'han aplicat tècniques d'amplificació isotèrmica a la microfluídica, incloent però no limitada a LAMP, amplificació de polimerasa recombinasa (RPA) i amplificació basada en seqüències d'àcid nucleic [65,66,67,68].Amb aquestes tècniques, els àcids nucleics s'amplifiquen a una temperatura constant, facilitant la creació de dispositius POCT portàtils de baix cost i alta sensibilitat per al diagnòstic molecular.
Els assaigs LAMP basats en microfluídica d'alt rendiment permeten la detecció múltiple de malalties infeccioses [42, 69, 70, 71].En combinació amb un sistema microfluídic centrífug, LAMP pot facilitar encara més l'automatització de la detecció d'àcids nucleics [69, 72, 73, 74, 75].El SlipChip gira i reacciona es va desenvolupar per a la detecció visual de múltiples bacteris paral·lels mitjançant LAMP [76] (Fig. 4a).Quan s'utilitzava LAMP optimitzat a l'assaig, la relació senyal-soroll de fluorescència era d'aproximadament 5 vegades i el límit de detecció va arribar a 7, 2 còpies/μl d'ADN genòmic. A més, es va visualitzar l'existència de cinc patògens bacterians digestius comuns, inclosos Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis i Vibrio parahaemolyticus, basant-se en el mètode en <60 min. A més, es va visualitzar l'existència de cinc patògens bacterians digestius comuns, inclosos Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis i Vibrio parahaemolyticus, basant-se en el mètode en <60 min.A més, es va visualitzar la presència de cinc patògens bacterians comuns del tracte digestiu, inclosos Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis i Vibrio parahaemolyticus, mitjançant aquest mètode en menys de 60 minuts.此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 视化 了 五 常见 消化道 细菌病 原体 的 存在 ， ， 包括 蜡状 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 沙门 菌 、 河流 弧菌 和 和 弧菌 弧菌 弧菌。。。。。。。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 副溶血 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPA més, es va visualitzar la presència de cinc patògens gastrointestinals bacterians comuns, inclosos Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius i Vibrio parahaemolyticus, mitjançant aquest mètode en menys de 60 minuts.
Els avantatges de LAMP en microfluídica inclouen, entre d'altres, la resposta ràpida i la detecció miniaturitzada.No obstant això, a causa de la temperatura de reacció (al voltant dels 70 °C), els aerosols es generen inevitablement durant el LAMP, donant lloc a una alta taxa de falsos positius.L'especificitat de l'assaig, el disseny d'imprimació i el control de la temperatura també s'han d'optimitzar per a LAMP.A més, els dissenys de xip que implementen la detecció de múltiples objectius en un sol xip són de gran valor i s'han de desenvolupar.A més, LAMP és adequat per a la detecció polivalent integrada en un xip, la qual cosa és de gran importància, però encara hi ha molt espai per al desenvolupament.
L'alta taxa de falsos positius de LAMP es pot reduir en part amb RPA, ja que la temperatura de reacció relativament baixa (~ 37 ° C) provoca relativament pocs problemes d'evaporació [77].En el sistema RPA, dos cebadors oposats inicien la síntesi d'ADN unint-se a una recombinasa i l'amplificació es pot completar en 10 minuts [78,79,80,81].Per tant, tot el procés RPA és molt més ràpid que PCR o LAMP.En els darrers anys, s'ha demostrat que la tecnologia microfluídica millora encara més la velocitat i la precisió de RPA [82,83,84].Per exemple, Liu et al.[85] va desenvolupar un assaig d'amplificació de recombinasa de polimerasa de flux lateral integrat microfluídic per a la detecció ràpida i sensible de SARS-CoV-2 integrant la transcripció inversa RPA (RT-RPA) i un sistema de detecció de tires de prova de flux lateral universal.en un únic sistema microfluídic.Figura 4b).El límit de detecció és d'1 còpia/µl o 30 còpies/mostra, i la detecció es pot completar en uns 30 minuts.Kong et al.han desenvolupat un dispositiu microfluídic usable.[86] va utilitzar la temperatura corporal i un sistema de detecció de fluorescència basat en telèfons mòbils per detectar ràpidament i directament l'ADN del VIH-1 mitjançant RPA (figura 4c).El test RPA portàtil detecta 100 còpies/ml de la seqüència objectiu en 24 minuts, demostrant un gran potencial per al diagnòstic ràpid de nadons infectats pel VIH-1 en entorns amb recursos limitats.
Amplificació isotèrmica en proves al punt de cura (POCT).Desenvolupament i producció de spin i reacció SlipChip.Després de la soldadura per plasma, els xips superior i inferior es van muntar amb un conjunt de femelles per formar el xip final (adaptat de [76]).b Esquema del sistema MI-IF-RPA per a la detecció de COVID-19 (adaptat de [85]).c Esquema d'una prova RPA per a la detecció ràpida de l'ADN del VIH-1 (adaptat de [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxifluoresceïna, virus de la immunodeficiència humana VIH, amplificació de la polimerasa recombinasa RPA, díode emissor de llum LED, la polimerasa microfluteràdica FAM-RPA integrada MI-IF-RPA Amplificació
L'RPA basat en microfluídics s'està desenvolupant ràpidament, però, el cost de fabricació de xips i el consum de reacció és massa elevat i s'ha de reduir per augmentar la disponibilitat d'aquesta tecnologia.A més, l'alta sensibilitat de l'RPA pot afectar l'amplificació de productes inespecífics, especialment en presència de contaminació.Aquestes limitacions poden afectar l'aplicació de RPA en sistemes microfluídics i mereixen una optimització addicional.També es necessiten cebadors i sondes ben dissenyats per a diversos objectius per millorar la viabilitat de les estratègies microfluídiques basades en RPA en POCT.
Cas13 i Cas12a tenen la capacitat de tallar aleatòriament àcids nucleics i, per tant, es poden desenvolupar com a eines de detecció i diagnòstic.Cas13 i Cas12a s'activen en unir-se a l'ADN o l'ARN objectiu, respectivament.Un cop activada, la proteïna comença a escindir altres àcids nucleics propers, després de la qual cosa els ARN de guia dirigits als àcids nucleics específics de patògens poden escindir sondes fluorescents extingides i alliberar fluorescència.A partir d'aquesta teoria, Kellner et al.[87] va desenvolupar un mètode basat en Cas13 [Specific High-sensibility Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], i Broughton et al.[88] va desenvolupar un altre enfocament basat en Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)].
En els darrers anys, han aparegut diversos mètodes per a la detecció d'àcids nucleics basats en CRISPR [89, 90].Els mètodes convencionals basats en CRISPR solen consumir temps i mà d'obra a causa de diversos procediments, com ara l'extracció d'àcids nucleics, l'amplificació i la detecció de CRISPR.L'exposició de líquids a l'aire pot augmentar la possibilitat de resultats falsos positius.Tenint en compte l'anterior, els sistemes basats en CRISPR necessiten una gran necessitat d'optimització.
S'ha desenvolupat una plataforma microfluídica controlada pneumàticament que pot realitzar 24 anàlisis en paral·lel per a aplicacions de detecció CRISPR-Cas12a i CRISPR-Cas13a [91].El sistema està equipat amb un dispositiu de detecció de fluorescència que evita l'amplificació d'àcids nucleics i detecta automàticament mostres d'ADN i ARN femtomolars.Chen et al.[92] va integrar l'amplificació de recombinasa amb el sistema CRISPR-Cas12a en microfluídica centrífuga (Fig. 5a).Aquest treball supera la dificultat d'integrar aquests dos processos perquè Cas12a pot digerir l'ADN missatger i inhibir el procés d'amplificació.A més, Chen et al.[92], a més, van preemmagatzemar els reactius de reacció en un control microfluídic centrífug per completar automàticament tot el procés.En un altre treball, Silva et al.[93] va desenvolupar un mètode de diagnòstic sense amplificació CRISPR/Cas12a i un telèfon intel·ligent per detectar SARS-CoV-2 (Fig. 5b).Aquest assaig, conegut com a sistema lliure d'amplificació basat en telèfons mòbils, inclou un enzim depenent de CRISPR/Cas que es basa en la visualització del telèfon intel·ligent de senyals de bombolles generades per catalasa en canals microfluídics.Detecció sensible de menys de 50 còpies/µl d'àcid nucleic sense amplificació prèvia, tot el procés, des de la injecció de la mostra fins a la lectura del senyal, només dura 71 minuts.
Mètodes de detecció d'àcids nucleics basats en CRISPR.POCT centrífug per al diagnòstic molecular integrat basat en CRISPR (adaptat de [92]).b Desenvolupament de la prova CASCADE per a l'anàlisi del SARS-CoV-2 basat en telèfons intel·ligents (adaptat de [93]).Amplificació de recombinasa RAA, motiu protoespaiador adjacent a PAM, repeticions palindròmiques curtes agrupades CRISPR a intervals regulars, sistema CASCADE sense amplificació de telèfon mòbil amb enzims dependents de CRISPR/CAS, clorhidrat d'1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida EDC
Com a darrer pas en la detecció d'àcids nucleics, la detecció del senyal reflecteix directament els resultats del diagnòstic i és un factor crític en el desenvolupament d'un POCT eficient, sensible i precís.Els senyals es poden llegir utilitzant diversos mètodes com ara estratègies fluorescents, electroquímiques, colorimètriques i magnètiques.En aquesta secció, descrivim la justificació de cada enfocament i comparem el diagnòstic molecular de malalties infeccioses en microfluídica.
Les estratègies basades en fluorescència s'utilitzen àmpliament per al diagnòstic POCT de malalties infeccioses a causa dels seus notables avantatges d'excel·lent sensibilitat, baix cost, facilitat d'operació i anàlisi al punt de cura [94, 95].Aquestes estratègies utilitzen fluoròfors marcats com ara tints fluorescents i nanomaterials per crear un senyal detectable (millora o extinció de la fluorescència).Aquesta troballa suggereix que les estratègies basades en la fluorescència es poden dividir en etiquetatge fluorescent directe, senyal encesa i detecció fluorescent de senyal apagada [96].La detecció directa d'etiquetes fluorescents utilitza etiquetes fluorescents especials per etiquetar lligands específics que generen una quantitat específica de fluorescència quan s'uneixen selectivament a un objectiu.Per a la detecció de fluorescència basada en senyal, la qualitat del senyal fluorescent està positivament relacionada amb la magnitud d'interès.La intensitat de la fluorescència és insignificant en absència d'un objectiu i es pot detectar quan hi ha una quantitat suficient d'objectiu.Per contra, la intensitat de la fluorescència detectada per la fluorescència "apagada" és inversament proporcional a la quantitat d'objectiu, arribant inicialment a un valor màxim i disminuint gradualment a mesura que s'amplia l'objectiu.Per exemple, utilitzant el mecanisme de trans-clivage depenent de la diana CRISPR-Cas13a, Tian et al.[97] va desenvolupar una nova estratègia de reconeixement per detectar els ARN que eviten la transcripció inversa directament (Fig. 6a).Després d'unir-se a ARN diana complementaris, es pot activar el complex CRISPR-Cas13-RNA, provocant la divisió transcolateral per part d'ARN reporters no específics.El reporter marcat amb fluorescència [fluoròfor (F)] s'apaga amb l'extintor (Q) intacte i fluoresceix quan el complex activat el trenca.
L'avantatge de la detecció electroquímica és l'alta velocitat de detecció, producció fàcil, baix cost, fàcil de transportar i control automàtic.És un mètode analític potent per a aplicacions POCT.Basat en transistors d'efecte de camp de grafè Gao et al.[98] va desenvolupar un nanobiosensor per a la detecció múltiple d'antígens de la malaltia de Lyme dels bacteris Borrelia burgdorferi amb un límit de detecció de 2 pg/mL (Fig. 6b).
Els assaigs colorimètrics s'han utilitzat en aplicacions POCT, beneficiant-se dels avantatges de la portabilitat, el baix cost, la facilitat de preparació i la lectura visual.La detecció colorimètrica pot utilitzar l'oxidació de la peroxidasa o nanomaterials semblants a la peroxidasa, l'agregació de nanomaterials i l'addició de colorants indicadors per convertir la informació sobre la presència d'àcids nucleics diana en canvis de color visibles [99, 100, 101].En particular, les nanopartícules d'or s'utilitzen àmpliament en el desenvolupament d'estratègies colorimètriques i, a causa de la seva capacitat per induir canvis de color ràpids i significatius, hi ha un interès creixent en el desenvolupament de plataformes colorimètriques POCT per al diagnòstic in situ de malalties infeccioses [102].Amb un dispositiu microfluídic centrífug integrat [103], els patògens transmesos pels aliments en mostres de llet contaminada es poden detectar automàticament a nivell de 10 cèl·lules bacterianes i els resultats es poden llegir visualment en 65 minuts (Fig. 6c).
Les tècniques de detecció magnètica poden detectar amb precisió els analits mitjançant materials magnètics, i hi ha hagut un interès important en les aplicacions POCT en les últimes dècades.Les tècniques de detecció magnètica tenen alguns avantatges únics, com ara materials magnètics de baix cost en lloc de components òptics cars.Tanmateix, l'ús d'un camp magnètic millora l'eficiència de detecció i redueix el temps de preparació de la mostra [104].A més, els resultats de la sonda magnètica demostren una alta especificitat, sensibilitat i una alta relació senyal-soroll a causa del senyal de fons magnètic insignificant de les mostres biològiques [105].Sharma et al.va integrar un biosensor basat en unió de túnel magnètic en una plataforma de microxip portàtil.[106] per a la detecció múltiple de patògens (Fig. 6d).Els biosensors detecten amb sensibilitat els àcids nucleics subnanomolars aïllats dels patògens.
Mètode típic de detecció de senyal.El concepte de detecció hiperlocalitzada de Cas13a (adaptat de [97]).b Nanobiosensor FET de grafè en combinació amb Lyme GroES scFv (adaptat de [98]).c Indicacions colorimètriques per a la detecció múltiple de patògens transmesos per aliments en un xip microfluídic centrífug: mostres núm. 1 i núm. 3 amb patògens diana, i mostres núm. 2, núm. 4 i núm. 5 sense patògens diana (adaptat de [103]) .d Biosensor basat en una unió de túnel magnètic, que inclou una plataforma, un amplificador de bloqueig integrat, una unitat de control i una font d'alimentació per a la generació/adquisició de senyal (adaptat de [106]).GFET Grafè FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polimetil metacrilat
Malgrat les excel·lents característiques dels mètodes de detecció anteriors, encara tenen desavantatges.Es comparen aquests mètodes (taula 1), incloent algunes aplicacions amb detalls (pros i contres).
Amb el desenvolupament de la microfluídica, els sistemes microelectromecànics, la nanotecnologia i la ciència dels materials, l'ús de xips microfluídics per a la detecció de malalties infeccioses avança constantment [55,96,107,108].La manipulació precisa d'equips i fluids en miniatura contribueix a la precisió del diagnòstic i la rendibilitat.Per tant, per al desenvolupament posterior, s'han fet esforços per optimitzar i actualitzar els xips, donant lloc a diversos xips microfluídics amb diferents estructures i funcions.Aquí presentem breument diversos tipus comuns de plataformes microfluídiques i comparem les seves característiques (pros i contres).A més, la majoria dels exemples enumerats a continuació se centren principalment en la lluita contra el SARS-CoV-2.
Els LOCC són els sistemes analítics complexos miniaturitzats més comuns i les seves operacions estan molt miniaturitzades, integrades, automatitzades i paral·lelitzades des de la injecció i preparació de mostres, control de flux i detecció de líquids [109, 110].Els líquids es manipulen mitjançant una geometria dissenyada amb cura i la interacció de molts efectes físics com ara gradients de pressió, acció capil·lar, electrodinàmica, camps magnètics i ones acústiques [111].LOCC mostra excel·lents avantatges en el cribratge d'alt rendiment i la detecció múltiple, amb una velocitat d'anàlisi ràpida, una mida de mostra petita, un baix consum d'energia i una alta eficiència de gestió i operació;tanmateix, els dispositius LOCC són molt delicats i la fabricació, l'embalatge i la interfície.Tanmateix, la multiplexació i la reutilització s'enfronten a enormes dificultats [96].En comparació amb altres plataformes, LOCC té avantatges únics pel que fa a la màxima diversitat d'aplicacions i la millor compatibilitat tecnològica, però els seus desavantatges també són evidents, és a dir, l'alta complexitat i la poca repetibilitat.La dependència de bombes externes, que sovint són voluminoses i cares, limita encara més el seu ús en POCT.
Durant el brot de COVID-19, LOCC va rebre molta atenció.Al mateix temps, hi ha diversos xips nous que combinen diverses tecnologies.Per exemple, ara els telèfons intel·ligents s'utilitzen àmpliament com a dispositius analítics portàtils i tenen un gran potencial per a la integració de LOCC.Sun et al.[21] va fabricar un xip microfluídic que permet multiplexar seqüències específiques d'àcid nucleic de cinc patògens, inclòs el SARS-CoV-2, utilitzant LAMP i les va analitzar amb un telèfon intel·ligent en una hora després del final de la reacció.Com a altre exemple, Sundah et al.[112] va crear un interruptor molecular [amplificació catalítica mitjançant interruptor d'estat de transició molecular (CATCH)] per a la detecció directa i sensible d'objectius d'ARN SARS-CoV-2 mitjançant telèfons intel·ligents. CATCH és compatible amb LOCC portàtil i aconsegueix un rendiment superior (aproximadament 8 còpies d'ARN/μl; <1 h a temperatura ambient) [112]. CATCH és compatible amb LOCC portàtil i aconsegueix un rendiment superior (aproximadament 8 còpies d'ARN/μl; <1 h a temperatura ambient) [112]. Agafeu совместим с п портативны и о обеспечивает превосходню производительность (примерно 8 коопий рн р [к [к [к. CATCH és compatible amb LOCC portàtil i proporciona un rendiment excel·lent (aproximadament 8 còpies d'ARN/µl; <1 h a temperatura ambient) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 Agafeu совместим с п портативныи LOCC и обладает превосходной производительнонннн (приеерно 8 копий р voshе. CATCH és compatible amb LOCC portàtils i té un rendiment excel·lent (aproximadament 8 còpies d'ARN/µl; <1 hora a temperatura ambient) [112].A més, els dispositius LOCC per al diagnòstic molecular també utilitzen algunes forces impulsores com ara el buit, l'estirament i els camps elèctrics.Kang et al.[113] va demostrar una PCR de nanoplasma en xip ultra ràpida en temps real per a un diagnòstic ràpid i quantitatiu de COVID-19 al camp mitjançant un xip de PCR líquid plasmònic al buit.Li et al.[114] va desenvolupar posteriorment un xip microfluídic impulsat per estiraments que va permetre el diagnòstic de COVID-19.La plataforma utilitza el sistema d'amplificació RT-LAMP per determinar si una mostra és qualitativament positiva o negativa.Posteriorment, Ramachandran et al.[115] van aconseguir gradients de camp elèctric adequats mitjançant isotacoforesi (ITP), una tècnica d'enfocament selectiu d'ions implementada en microfluídica.Amb ITP, es pot purificar automàticament l'ARN objectiu de mostres de hisop nasofarínge.Aleshores Ramachandran et al.[115] La combinació d'aquesta purificació d'ITP amb assajos LAMP i CRISPR millorat amb ITP va detectar SARS-CoV-2 en un hisop nasofarínge humà i mostres clíniques en uns 35 minuts.A més, contínuament sorgeixen noves idees.Jadhav et al.[116] va proposar un esquema de diagnòstic basat en l'espectroscòpia Raman millorada a la superfície en combinació amb un dispositiu microfluídic que conté nanotubs de carboni recoberts d'or/plata orientats verticalment o micro/nanotubs electrospun d'un sol ús.Els microcanals de filtre integrats funcionalitzats amb membrana són d'un sol ús.El dispositiu adsorbeix virus de diversos líquids/exsudacions corporals com la saliva, la nasofaringe i les llàgrimes.Així, el títol del virus és abundant i el virus es pot identificar amb precisió mitjançant la signatura Raman.
LOAD és una plataforma microfluídica centrífuga en la qual tots els processos estan controlats per un protocol de freqüència que gira un substrat microestructurat [110].El dispositiu LOAD es caracteritza per utilitzar la força centrífuga com a força motriu important.Els líquids també estan subjectes a forces capil·lars, d'Euler i de Coriolis.Mitjançant un dispositiu de centrífuga, les anàlisis es realitzen en funcionament líquid continu des d'una posició radial cap a dins cap a l'exterior, eliminant la necessitat de tubs externs addicionals, bombes, actuadors i vàlvules actives.En resum, un únic mètode de control simplifica el funcionament.Les forces que actuen sobre el líquid en el mateix canal microfluídic a la mateixa distància del centre de càrrega són iguals, cosa que permet repetir l'estructura del canal.Així, els equips LOAD són més senzills i econòmics de dissenyar i fabricar que els equips LOCC convencionals, mentre que les reaccions són en gran part independents i paral·lelisades;no obstant això, a causa de l'alta resistència mecànica dels equips centrífugs, el material d'encenall disponible és limitat i els volums petits són difícils.al cotxe.Al mateix temps, la majoria dels dispositius LOAD estan dissenyats només per a un sol ús, cosa que és car per a la detecció a gran escala [96, 117, 118, 119].
En les últimes dècades, LOAD, considerat un dels dispositius microfluídics més prometedors, ha rebut una atenció considerable d'investigadors i fabricants.Així, LOAD ha guanyat una àmplia acceptació i s'ha utilitzat per al diagnòstic molecular de patògens infecciosos [120, 121, 122, 123, 124], especialment durant el brot de COVID-19.Per exemple, a finals de 2020, Ji et al.[60] va demostrar un assaig directe RT-qPCR per a la detecció paral·lela ràpida i automatitzada d'infeccions per SARS-CoV-2 i grip A i B en mostres d'hisop de gola.Aleshores Xiong et al.[74] va presentar una plataforma microfluídica discoide integrada amb LAMP per a la detecció ràpida, precisa i simultània de set coronavirus respiratoris humans, inclòs el SARS-CoV-2, en 40 minuts.A principis de 2021, de Oliveira et al.[73] va demostrar un xip microfluídic centrífug de tòner de poliestirè, operat manualment amb un rotador de la punta dels dits, per al diagnòstic molecular RT-LAMP de COVID-19.Posteriorment, Dignan et al.[39] va presentar un microdispositiu de centrífuga portàtil automatitzat per a la purificació de l'ARN SARS-CoV-2 directament a partir de seccions de hisop bucal.Medved et al.[53] va proposar un sistema de mostreig d'aerosol SARS-CoV-2 en línia amb un xip fluorescent microfluídic rotatiu de petit volum amb un límit de detecció de 10 còpies/μL i un llindar de cicle mínim de 15 minuts.Suárez et al.[75] va informar recentment del desenvolupament d'una plataforma microfluídica centrífuga modular integrada per a la detecció directa de l'ARN SARS-CoV-2 en mostres de hisop nasofarínge inactivades per calor mitjançant LAMP.Aquests exemples demostren els grans beneficis i la promesa de LOAD en el diagnòstic molecular de COVID-19.
El 1945 Muller i Clegg [125] van presentar per primera vegada canals microfluídics sobre paper utilitzant paper de filtre i parafina.El 2007, el grup Whitesides [126] va crear la primera plataforma de paper funcional per a proves de proteïnes i glucosa.El paper s'ha convertit en un substrat ideal per a la microfluídica.El paper té propietats inherents, com ara hidrofílicitat i estructura porosa, excel·lent biocompatibilitat, pes lleuger, flexibilitat, plegabilitat, baix cost, facilitat d'ús i comoditat.Els µPAD clàssics consisteixen en estructures hidròfiles/hidròfobes construïdes sobre substrats de paper.Depenent de l'estructura tridimensional, els μPAD es poden dividir en μPAD bidimensionals (2D) i tridimensionals (3D).Els µPAD 2D es produeixen formant límits hidrofòbics per formar canals microfluídics, mentre que els µPAD 3D es fan generalment a partir de piles de capes de paper microfluídic 2D, de vegades mitjançant el plegat de paper, tècniques de lliscament, canals oberts i impressió 3D [96].Els fluids aquosos o biològics del μPAD es controlen principalment per força capil·lar sense una font d'alimentació externa, facilitant l'emmagatzematge previ dels reactius, la manipulació de mostres i la detecció múltiple.Tanmateix, el control precís del flux i la detecció múltiplex es veuen obstaculitzats per la velocitat de detecció, la sensibilitat i la reutilització insuficients [96, 127, 128, 129, 130].
Com a plataforma microfluídica inusual, μPAD s'ha promogut i desenvolupat àmpliament per al diagnòstic molecular de malalties infeccioses com el VHC, el VIH i el SARS-CoV-2 [131, 132].Per a la detecció selectiva i sensible del VHC, Tengam et al.[133] va desenvolupar un nou biosensor basat en paper fluorescent utilitzant una sonda d'àcid nucleic molt específica basada en pèptid pirrolidinil.Els àcids nucleics s'immobilitzen covalentment en paper de cel·lulosa parcialment oxidat per alquilació reductora entre grups amino i grups aldehids, i la detecció es basa en la fluorescència.Aquests senyals es poden llegir amb un aparell fet especialment amb una càmera fluorescent portàtil en combinació amb una càmera de telèfon mòbil.Posteriorment, Lu et al.[134] va dissenyar un elèctrode flexible basat en paper basat en compostos de marc organometàl·lic de nanopartícules de níquel/or/nanotubs de carboni/alcohol polivinílic per a la detecció d'objectius del VIH mitjançant la hibridació d'ADN utilitzant blau de metilè com a indicador redox d'ADN.Més recentment, Chowdury et al.[135] va presentar un disseny hipotètic de plataforma per a proves de µPAD al punt de cura mitjançant saliva crua del pacient en combinació amb LAMP i tecnologia d'imatge portàtil per a la detecció d'analits COVID-19.
Les proves de flux lateral guien els fluids per forces capil·lars i controlen el moviment del fluid per la humectabilitat i les característiques dels substrats porosos o microestructurats.Els dispositius de flux lateral consten de mostra, conjugat, incubadora i detecció i coixinets absorbents.Les molècules d'àcid nucleic del LFA reconeixen aglutinants específics que s'emmagatzemen prèviament al lloc d'unió i s'uneixen com a complexos.A mesura que el líquid travessa les plaques d'incubació i detecció, els complexos són capturats per les molècules de captura situades a les línies de prova i control, mostrant resultats que es poden llegir directament a ull nu.Normalment, l'LFA es pot completar en 2-15 minuts, que és més ràpid que el descobriment tradicional.A causa del mecanisme especial, LFA requereix poques operacions i no requereix equips addicionals, cosa que el fa molt fàcil d'utilitzar.És fàcil de fabricar i miniaturitzar, i el cost dels substrats basats en paper és més baix.Tanmateix, només s'utilitza per a anàlisis qualitatives i la detecció quantitativa és molt difícil, i la capacitat de multiplexació i el rendiment són molt limitats, i només es pot detectar un àcid nucleic suficient alhora [96,110,127].
Tot i que la majoria de les aplicacions de LFA se centren en immunoassajos, l'ús de LFA per al diagnòstic molecular en xips microfluídics també és eficaç i popular [136].En el cas del virus de l'hepatitis B, el VIH i el SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] va proposar una plataforma LFA de nanopartícules de conversió superior i va demostrar la versatilitat d'aquesta plataforma miniaturitzada i portàtil mitjançant la detecció sensible i quantitativa de múltiples dianes com l'àcid nucleic del VHB.A més, Fu et al.[138] va demostrar un nou LFA basat en l'espectroscòpia Raman millorada en superfície per a l'anàlisi quantitativa de l'ADN del VIH-1 a concentracions baixes.Per a la detecció ràpida i sensible del SARS-CoV-2, Liu et al.[85] va desenvolupar una anàlisi de flux lateral RPA integrat amb microfluídic combinant RT-RPA i un sistema de detecció de flux lateral universal en un únic sistema microfluídic.
L'aplicació de diverses plataformes microfluídiques varia en funció d'estudis concrets, aprofitant al màxim les capacitats i avantatges de les plataformes.Amb vàlvules, bombes i conductes assequibles, LOCC és la plataforma més completa per a la diversitat d'aplicacions i la interoperabilitat amb el major marge de desenvolupament.Per tant, esperem i recomanem que els estudis més recents es facin a LOCC com a primer intent i que s'optimitzin les condicions.A més, s'espera que es descobreixin i utilitzen mètodes més eficients i precisos al sistema.LOAD destaca en el control precís dels fluids dels dispositius LOCC existents i demostra avantatges únics en accionaments individuals mitjançant força centrífuga sense necessitat d'accionaments externs, mentre que les respostes paral·leles es poden separar i sincronitzar.Així, en el futur, LOAD es convertirà en la principal plataforma microfluídica amb menys operacions manuals i tecnologies més madures i automatitzades.La plataforma µPAD combina els avantatges del LOCC i dels materials basats en paper per a diagnòstics d'un sol ús i de baix cost.Per tant, el desenvolupament futur hauria de centrar-se en tecnologies convenients i ben establertes.A més, l'LFA és molt adequat per a la detecció a ull nu, prometent reduir el consum de mostres i accelerar la detecció.A la taula 2 es mostra una comparació detallada de la plataforma.
Les anàlisis digitals divideixen la mostra en molts microreactors, cadascun dels quals conté un nombre discret de molècules diana [139, 140].Els assajos digitals ofereixen avantatges significatius per realitzar una quantificació absoluta mitjançant la realització de milers d'experiments bioquímics paral·lels simultàniament i individualment en compartiments a escala de micres més que en una fase contínua.En comparació amb la microfluídica tradicional, les reaccions del compartiment poden reduir el volum de la mostra, augmentar l'eficiència de la reacció i integrar-se fàcilment amb altres mètodes analítics sense necessitat de canals, bombes, vàlvules i dissenys compactes [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Els dos mètodes següents s'utilitzen en assajos digitals per aconseguir una separació uniforme i precisa de solucions, incloent reactius i mostres com cèl·lules, àcids nucleics i altres partícules o molècules: (1) emulsions de gota que exploten la inestabilitat de la interfície líquida;(2) la divisió de matriu es realitza mitjançant les restriccions geomètriques del dispositiu.En el primer mètode, es poden crear gotes que contenen reactius i mostres en microcanals mitjançant mètodes passius com ara co-corrent, flux creuat, enfocament de flux, emulsificació per etapes, emulsificació de microcanals i membranes mitjançant forces de tall viscoses i emulsificació amb canvi de canal.localització [143, 145, 146, 148, 149] o utilitzant mètodes actius [150, 151], que introdueixen energia addicional a través del control elèctric, magnètic, tèrmic i mecànic.En aquest últim enfocament, la millor uniformitat de volum de fluid a les cambres microfluídiques es comparteix mantenint estructures espacials de la mateixa mida, com ara microfoses i matrius de superfície [152,153,154].En particular, les gotes són grans seccions de flux que també es poden generar i manipular en matrius d'elèctrodes basades en microfluídica digital (DMF).L'electrohumectació dels dielèctrics és una de les teories DMF més ben estudiades, ja que l'electrohumectació dels dielèctrics permet una manipulació precisa de les gotes individuals, controlant la forma del líquid i els senyals elèctrics asimètrics que passen per diferents costats [141, 144].Les principals operacions amb gotes en DMF inclouen l'ordenació, la divisió i la fusió [151, 155, 156], que es poden aplicar en diversos camps d'anàlisi, especialment en la detecció molecular [157, 158, 159].
La detecció digital d'àcids nucleics és una tecnologia de diagnòstic molecular de tercera generació que segueix la PCR convencional i la PCR quantitativa en temps real (qPCR), en paral·lel amb la seqüenciació d'alt rendiment i la biòpsia líquida.En les dues últimes dècades, els àcids nucleics digitals s'han desenvolupat ràpidament en el camp del diagnòstic molecular de patògens infecciosos [160, 161, 162].La quantificació absoluta de la detecció digital d'àcids nucleics comença amb l'embalatge de mostres i reactius en compartiments individuals per garantir que cada seqüència objectiu tingui la mateixa probabilitat d'entrar a cada compartiment individual.Teòricament, a cada secció se li poden assignar múltiples seqüències diana, o pot ser que no hi hagi un sistema de microreacció independent.Mitjançant els diferents mecanismes de detecció descrits anteriorment, els compartiments amb seqüències diana microbianes que generen senyals per sobre d'un determinat llindar es poden visualitzar a ull nu o mitjançant una màquina i s'etiqueten com a positius, mentre que altres compartiments que generen senyals per sota del llindar s'etiqueten com a positius. .negatives, que fan que el senyal de cada secció sigui booleà.Així, calculant el nombre de compartiments creats i la taxa de resultats positius després de la reacció, les còpies originals de les mostres de prova es poden emparellar mitjançant la fórmula de distribució de Poisson sense necessitat d'una corba estàndard, que es requereix per a anàlisis quantitatives rutinàries com ara com qPCR.[163] En comparació amb els mètodes tradicionals de diagnòstic molecular, la detecció digital d'àcids nucleics té un major grau d'automatització, una major velocitat d'anàlisi i sensibilitat, menys reactius, menys contaminació i un disseny i fabricació més senzills.Per aquests motius, l'ús d'assajos digitals, especialment mètodes basats en gota, per al diagnòstic molecular, que combinen tècniques d'amplificació i lectura de senyals, ha estat ben estudiat durant el brot crític de SARS-CoV-2.Per exemple, Yin et al.[164] va combinar mètodes digitals de gotetes i PCR ràpides per detectar els gens ORF1ab, N i RNasa P en SARS-CoV-2 en un xip microfluídic.En particular, el sistema va ser capaç d'identificar un senyal positiu en 115 segons, que és més ràpid que la PCR convencional, cosa que indica la seva eficàcia en la detecció al punt de cura (figura 7a).Dong et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] i Alteri et al.[167] també va aplicar la PCR digital en gotetes (ddPCR) per detectar SARS-CoV-2 en un sistema microfluídic amb resultats impressionants.Per millorar encara més la taxa de detecció, Shen et al.[168] va aconseguir imatges de xip basades en ddPCR en tan sols 15 s sense l'ús de tècniques de costura d'imatges, accelerant el procés de la tecnologia ddPCR des del laboratori fins a l'aplicació.No només s'apliquen mètodes d'amplificació tèrmica com la PCR, sinó que també s'utilitzen mètodes d'amplificació isotèrmica per simplificar les condicions de reacció i la resposta ràpida.Lu et al.[71] va desenvolupar SlipChip per a l'anàlisi de gotes, capaç de generar gotes de diverses mides a altes densitats en un sol pas i quantificar els àcids nucleics SARS-CoV-2 mitjançant LAMP digital (figura 7b).Com a tecnologia en evolució ràpida, CRISPR també pot tenir un paper important en la detecció digital d'àcids nucleics mitjançant una còmoda imatge colorimètrica sense necessitat de taques addicionals d'àcid nucleic.Ackerman et al.va desenvolupar una reacció de matriu combinatòria per a l'avaluació múltiple d'àcids nucleics.[158] van detectar 169 virus associats a humans, inclòs el SARS-CoV-2, en gotes que contenien reactius de detecció d'àcids nucleics basats en CRISPR-Cas13 en un assaig de micropous (figura 7c).A més, l'amplificació isotèrmica i la tecnologia CRISPR es poden utilitzar en el mateix sistema per combinar els beneficis d'ambdues.Park et al.[169] Es va desenvolupar un assaig digital CRISPR/Cas12a en un xip microfluídic comercial per a la detecció de SARS-CoV-2 extret i mort per calor basat en un RT-RPA d'una sola etapa amb una detecció de senyal a fons més curta i més alta. relació de temps., rang dinàmic més ampli i millor sensibilitat (Fig. 7d).Algunes descripcions d'aquests exemples es donen a la Taula 3.
Plataforma digital típica per a la detecció d'àcids nucleics.a El flux de treball de PCR digital ràpida consta de quatre passos clau: preparació de la mostra, distribució de la mescla de reacció, procés d'amplificació i quantificació de l'objectiu (adaptat de [164]).b Esquema que mostra l'anàlisi de les gotes de SlipChip per a la formació de gotes a alta densitat (adaptat de [71]).c Diagrama de flux de treball CARMEN-Cas13 (adaptat de [158]).d Visió general de la detecció digital avançada de virus amb CRISPR/Cas en un pot (adaptat de [169]).W/O aigua en oli, polidimetilsiloxà PDMS, reacció en cadena de la polimerasa PCR, recollida de dades DAQ, derivada integral proporcional PID, reacció de matriu combinatòria CARMEN per a l'avaluació múltiple d'àcids nucleics, SARS-CoV-2, síndrome respiratòria aguda severa, coronavirus 2 , RT Amplificació de la transcriptasa inversa recombinasa polimerasa-RPA, senyal S/B en segon pla
Hora de publicació: 15-set-2022
